第5章 免疫血清学检验技术PPT.ppt

第五章 免疫血清学 检验技术;第一节 凝集与沉淀反应 第二节 放射免疫测定技术 第三节 免疫荧光技术 第四节 酶免疫测定 第五节 固相膜免疫测定;凝集反应： 细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。;凝集反应过程： 抗原抗体的特异性结合 出现肉眼可见的凝集现象 凝集反应特点： IgM的作用比IgG大数百倍 IgG与抗原结合后，常不出现凝集现象，称不完全抗体 临床意义： 进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。;;直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。;（一）玻片凝集试验;（二）试管凝集试验;间接凝集反应(indirect agglutination)： 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。 载体种类： RBC（醛化）；聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）； 金黄色葡萄球菌。;;;用抗原致敏载体--检测抗原;coagglutination test：以金黄色葡萄球菌菌体为反应的载体。人及多种哺乳动物（猪、兔、豚鼠等）血清中IgG抗体的FC段与菌体表面的A蛋白（SPA）非特异性结合后，IgG的两个Fab段仍然暴露在菌体表面，保持着结合抗原的活性和特异性。当与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。 SPA--(Fc)IgG(Fab)--Ab SPA：staphylococcal protein A;（二）正向间接血凝试验;;（三）反向胶乳凝集试验; 将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉眼可见的粉红色凝集 ;抗原的检测 反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。 抗体的检测 　　检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。 ;未经致敏的受检者新鲜红细胞 试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体 临床应用：HIV检测、HBV检测;五、 抗球蛋白试验（Coombs试验）;（一）直接Coombs试验;（二）间接Coombs试验; 可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和温度)下，经一定时间，于比例合适处形成肉眼可见的沉淀现象。;沉淀反应;（一）单向琼脂扩散试验;大分子抗原和长时间扩散（＞48h）：C=k×d2 小分子抗原和较短时间（24h）：logC=k×d;（二）双向琼脂扩散试验;加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。;三孔型双向免疫扩散可能的结果;（三）对流免疫电泳试验;（四）火箭电泳 Rocket Electrophoresis;火箭电泳示意图;早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。;常用标记核素;一、放射免疫分析;以未结合的Ag*为F，Ag*-Ab复合物为B，则B/F或B/T(B＋F)与Ag的量变存在着剂量-反应曲线。;2、实验方法及测定;二抗体沉淀法 ;二、免疫放射分析;2、单位点 IRMA;3、双位点 IRMA;; 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。;均相荧光免疫测定 时间分辨荧光免疫测定 荧光酶免疫测定;荧光物质;时间分辨检测原理示意图;镧系元素 铕(Eu3+)（最常用）；钐(Sm3+)；铽(Tb3+)；钕(Nd3+)；镝(Dy3+);3、信号增强作用;固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物在酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。;待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。;待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。;荧光偏振免疫测定原理示意图 ;荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 ;标记酶; 固相抗体和酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入