日本乙型脑炎病毒SA14142单克隆抗体的研制.pdfVIP

第十三次学术研讨会会议论文集 氨基酸在130到234位的区域外发生改变的病毒株，可能与其选择性细胞通路和免疫抑制有关。 与疫苗株SA14一14—2相比，5株压V华东分离株的NSl基因在16个位点存在碱基的多态性， 但编码氨基酸主要在4个位点发生变异，集中位于NSl蛋白的C端。由于厄VNSl的C端是其主 要免疫抗原区域，JEV流行毒株NSl的这四个氨基酸的变异是否改变其抗原性值得进一步深入研究。 参考文献(略) 日本乙型脑炎病毒SAl4．14．2单克隆抗体的研制 余慧l曹三杰黄小波文心田 (四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室，四川省动物疫病与人类健康重点实验室，四川 雅安 625014) 摘要利用BHK．2l细胞常规增殖乙脑病毒，设未接种JEv病毒的BHK，2l细胞为对照抗原，同时经浓缩及超速离心 后，将所得样品作为免疫抗原常规途径免疫BALB，c小鼠。取小鼠脾细胞与SP加骨髓瘤细胞进行融合，最终选取试剂 盒检测0D45唯最高者经有限稀释法进行4次亚克隆。结果显示：常规免疫组的融合率约34％，阳性率近l％，共获 得3株能稳定分泌抗JEV病毒的杂交瘤细胞系，分别命名为厄V．1、JEV-2、JEv3。经亚型鉴定试剂盒检测JEv．1、疆V．2、 JEV3抗体亚类均为：IgGl，轻链为-f型；间接ELIsA方法检测到3株杂交瘤细胞均具有良好的传代及热稳定性，细胞 培养上清效价均为103，免疫小鼠所制备的腹水效价为105，血清中的抗体效价为104：相加试验证实此3株细胞系针 对的抗原决定簇存在一定差异；特异性试验及间接免疫荧光试验证实三株单抗均具有良好的特异性；各株单抗的相 对亲和力分别为： JEV．15mol／L、JEV24mol，L、JEv．35nlo扎。 关奠词 日本乙型脑炎病毒；单抗的制备：鉴定； encephalitisvims，厄V)，简称乙脑病毒，属于黄病毒 乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(JapaJlese 前，预防乙型脑炎最常用的是鼠脑组织灭活疫荫、原代地鼠肾细胞灭活苗及原代地鼠细胞培养的减 毒活疫苗，而1989年，我国成功研制的乙型脑炎减毒活疫苗SAl4．14．2株，其稳定性已经得到世界卫 生组织的认可¨J。现今，乙脑病毒的单抗已成功应用到临床治疗上，这为乙脑的免疫治疗开辟了新 的途径，同时对其他医学病毒性传染病的研究和治疗也将起到推动作用。 l材料与方法 1．1材料 1．1．1毒株、细胞系与实验动物 苗毒、BHK．21细胞、SP2／0细胞等均由四川农业大学动物传染病与基因芯片实验室保存；JEV阳性 血清(自制)；6—8周龄BALB／c(雄)小鼠，购于四川大学试验动物中心。 1．1．2主要试剂及配制 HAT，HT筛选培养基、RPMI MoloclonalIsotyping飚t亚型鉴定试剂盒、 相关溶液、定性．乙脑病毒IgG诊断试剂盒、Mouse An曲ody 标准胎牛血清、融合剂PEGl450等。 1．2方法 1．2．1免疫抗原的增殖与纯化 常规增殖病毒，将收获的厄V病毒反复冻溶3次后，PEG6000及Nacl浓缩初提抗原，将粗提 抗原45000r离心3h，加少量PBs重悬病毒沉淀，测定蛋白含量，将未接毒的正常细胞也同上作相 1基金项目：国家公益性行业科研专项项目资助 教育部长江学者和创新团队发展计划项目(Ⅱm848)资助 人兽共患病一病毒病 同处理后作为对照抗原。 1．2．2单克隆抗体的制备 1．2．2．1动物免疫：常规免疫方法。 1．2．2．2细胞融合 提前1．2周左右复苏培养SP2／0细胞并进行HGPRT缺陷型鉴定，常规方法制备脾细胞及饲养细胞， 采用PEGl450进行融合。融合率=杂交瘤细胞孔数／全数细胞孔 1．2．2．3杂交瘤细胞的亚克隆：按有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。 1．2．3单克隆抗体的鉴定 1．2．3．1 间接ELISA方法的建立 采用方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，实验时同时设立正常SP2／o细胞培养 上清液及空白对照。用已建立的间接ELISA方法检测定15份阴性小鼠血清：阴阳性临界值=阴性血清 OD450mn值的平均值X+