基因工程蛋白金葡菌 溶血素的纯化及活性检测.pdfVIP

其他论文 因，可用于后期构建真核表达质粒。 TLR3分布在胎盘和胰腺等组织和巨噬细胞、单核细胞中，主要表达于细胞核内体，仅当配体到 s仃aIldedRNA，dsRNA) 达这些部位时才能被这些TLR3识别。TLR3能专一性地识别双链RNA(doubIe 诱导NF—KB的转位和IFNa和IFNB的表达，促发前炎症因子及辅助刺激分子的释放，调节机体细胞非 别，激起机体抗病毒的免疫防御反应lI…。 间，与小鼠全长TLR9基因(3099bp)的表达相比偏小，与预期结果相符。表明本研究构建的小鼠 全长TLR3重组质粒能够在293T细胞上大量表达，为以后进一步研究病毒与’几R3之间的关系奠定 了基础。 参考文慧(略) 基因工程蛋白金葡菌．溶血素的纯化及活性检测 张海燕1·2马卫明1杨宏军2王长法2何洪彬2曹永芝1 (1山东农业大学动物科技学院，山东泰安27l叭8； 2山东省农业科学院奶牛研究中心，山东济南250100) 摘要 【目的1分离纯化基因工程重组蛋白金黄色葡萄球菌溶血素(．hemolysiIl，。HL)并检测其生物学活性，为疫 苗研发奠定基础。 (DE3)培养物用超声波裂解，并用凝胶过滤层析法对该基因工程蛋白进行分离纯化，用Bradfbrd法及兔红细胞分别 测定纯化产物的蛋白含量和溶血比活．I结果l纯化产物在sDs。P：AGE电泳中53l(Il处呈现出单一清晰带，达电泳级 纯度。纯化产物含量约为O．1277m鲈IlL，溶血比活为8192Hu触g。I结论l成功获得了金黄色葡萄球菌甩，．且所 荻的HL具有艮好的溶血活性． 关奠词 溶血素；金黄色葡萄球菌；溶血活性；基因工程蛋白；原核表达 奶牛乳腺炎(Mastitis)是造成奶牛业经济损失的最主要原因之一lIJ，而且还给人类的健康带来 了潜在的危害。两年来，研究人员对山东省奶牛场临床型乳腺炎的流行病学进行了较为细致的研究， 沙门氏菌和大肠杆菌的检出率分别为52％，21．1％和9．24％，证实金葡菌是引起该地区奶牛乳腺炎 的主要病原菌。溶血素(Hemolysin，甩)，亦称毒素。是金葡菌的重要毒力因子之一…，具有良好 的抗原性，经甲醛处理可制成类毒素。近年来国内外研究成果表明，基因工程亚单位疫苗由于其具 有大剂量高度纯化的抗原、无遗传物质及宿主和培养基的成分等优点，在动物传染病的免疫预防中 应用较为广泛【3j。目前，有关金葡菌HL基因工程重组蛋白的研究还较少。本研究拟在张善瑞等【2】 成功表达的金葡菌 肌基因工程重组蛋白的基础上，应用凝胶过滤层析、法【3】对此基因工程蛋白进行 分离纯化，并对蛋白含量和溶血活性f4J进行检测，以期为今后疫苗的研发奠定基础，也为进一步开 展金葡菌HL致病机理与免疫机理的研究提供理论依据。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌种 ．肌重组质粒的重组菌BL21(DE3)由山东省农业科学院奶牛研究中心实验室构建 含pET32a+． 【21并保存。 1456 第十三次学术研讨会会议论文集 1．1．2试剂 自Phamacia公司，牛血清白蛋白购自Roche公司，凝胶过滤层析柱(14nun×900 mm)购自上海锦 华层析设备厂，其他试剂均为国产分析纯级。 1．1．3主要仪器 1．2主要试剂的配制 SDS．聚丙烯酰胺凝胶(P：AGE)、IPTG(24m∥mL)、氨苄青霉素(Ampicillin，100m幽_IlL)以及 LB培养基的配制和保存均参照TaK出a宝生物工程(大连)实验室常规试剂配制方法进行。 1．3金葡菌HL诱导表达 mL 将重组菌BL2l(DE3)接种于500LB培养基中，37℃恒温摇床孵育8h，紫外分光光度计测 oD600值，在OD600值为0．4～0．6时加入24IPTG，使其终浓度为lmmo儿【5】’37℃继续孵育4h。 mg／nlL 1．4金葡菌HL的提取