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如何设计高效的siRNA 许德晖 西安交大医学院遗传教研室 1 RNA干扰的发现过程 2 RNA干扰的机制 3 siRNA的设计 1.建立数据库进行统计学分析 2.mRNA二级结构的预测与影响 3.risc装配siRNA的不对称性 4.argo蛋白的paz及piwi结构域 5.错配的影响及脱靶的控制 6.排除无效的siRNA 7.各种化学修饰的影响 8.一些siRNA设计网址及软件 RNAi的发现 RNAi现象早在1993年就有报道： 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色[1]。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。 1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。 反义RNA 基因沉默 正义RNA 也沉默了 ? 为什么正义的RNA也会导致沉默? 寻找原因:传统的RNA提纯方法有缺陷,总是会混有少量的dsRNA 纯化RNA 真正的结果出来了 1998年， Andrew Fire的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是 双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的 反义RNA 中等沉默效应 正义RNA 几乎没有效应 双链RNA 强大的沉默效应 结论:真正起作用的是纯化过程中混杂的少量dsRNA RNA干扰理论诞生了 随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。 那么,哺乳动物中有没有RNAi呢? 把长的dsRNA(以前的实验都是这样做的)导入哺乳动物成体细胞后，发现细胞内的病毒防御机制被激活。产生了干扰素样反应，蛋白激酶PKR激活，使转录因子E2F被抑制，非特异的阻断基因的转录，并诱导细胞凋亡 结论:哺乳动物不存在RNAi 认为: 随着生物的进化,高等动物完善的免疫系统取代了低等生物内RNA干扰所担负的抵抗病毒和外源性微生物侵袭的功能，因此，RNA干扰机制在高等动物体内不再存在。 真的是这样的吗？ 那为什么试验会没有结果？ 会不会是我们在实验设计及方法上有所缺陷（像上面那个实验）？ tuschl做到了 他们通过分析在低等生物和植物体内自然产生的执行RNA干扰功能的中介分子--——siRNA分子，发现这些都是21-28个nt的小双链RNA，每链的3‘端都有2-3个的悬垂核苷酸，5’端第一个核苷酸都被磷酸化了。这种结构都是Dicer等RNA酶切割dsRNA后产物所特有的。 如果直接导入siRNA分子呢？siRNA分子足够小，不会引起干扰素样反应。会出现什么结果。。。 根据siRNA的共同特点，通过化学合成，直接把siRNA导入哺乳动物细胞内。 发现：siRNA能够高效抑制目的基因的表达，而且是通过标准的RNA干扰途径！ 从此打破了RNAi不存在于哺乳动物的论断，RNAi被广泛用于哺乳动物的基因功能研究。 tuschl的设计原则也被认为是经典的siRNA设计原则 tuschl的siRNA经典设计原则 1 从起始密码下游50—100nt开始有哪些信誉好的足球投注网站，避免5‘或3’端的UTRs，因为有蛋白结合位点。 2 有哪些信誉好的足球投注网站5‘AA（N19）UU序列 没有的话也可以用5’AA（N21）或5‘NA（N21）保证G/C含量50%左右，最好能在32%--79%之间 3 Blast对照，确定只有目标基因与其互补 4 设置对照siRNA，最好是针对细胞内所没有的基因 RNAi的机制 1） 起始阶段：dsRNA进入细胞的方式可以是外源导入或者转基因、病毒感染等。引入的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中特异识别dsRNA的Dicer 酶,以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约21-23nt的由正反义链组成的双链小分子干扰RNA(siRNA)，且每条单链的3’端都带有2个突出的非 配对碱基（多数是UU）。siRNA又被称为引导RN