酶联免疫吸附实验（ELISA）系列讲座二.docVIP

ELISA系列讲座二 ELISA技术中的抗原与抗体的反应 抗体 1.2.1　抗体的结构 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为 IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda ）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu ）链。 重链和轻链的 N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹 配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。 IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一 个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。 IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解 成小分子多肽，无生物活性。 IgM是由五个单体组成的五聚体，含 10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000， IgG分子量约为150000。 机体被微生物感染后，先产生 IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年 之久。 IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。右图为为甲型肝炎 病人血清中IgG抗体和IgM抗体出现的时间和水平。 1.3　抗原抗体反应 1.3.1　可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数K表示： K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离 后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的IgG抗体仅占总IgG中 的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。 1.3.2　最适比例 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1-4。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zone of equivalence）。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中 称为带现象（zone phenomenon）。抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学方法测定抗 原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。 1.3.3　特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原 抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原（ HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体 反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物 。 但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如：绒毛膜促性腺激素（ hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫 动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的 α酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则 妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须 应用只对hCG特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。 1.3.4　敏感性 在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为 mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记