第五章 目的基因的获取 3.ppt

部分补平的载体DNA与部分补平 的酶切片段连接 重组λDNA的包装(packaging) 噬菌体由λDNA和蛋白质外壳组成, 离体条件下连接产生的重组λDNA可与商业公司提供的包装蛋白组装成有活性的噬菌体(phage) 重组λDNA与包装蛋白在22℃共保温3h即完成包装 所有大小的DNA片段均可成功与载体连接, 但只有大小居于15-23kb之间的片段与载体连接后方可包装成有繁殖能力的噬菌体 滴度测定(titering) 噬菌体溶液与大肠杆菌(LE392或KW251)溶液混和, 37℃保温30min后与45℃的Top agarose混和, 铺于LB平板上 培养数小时至过夜后会出现噬菌斑, 每个斑对应于原先的一个噬菌体粒子 文库的效率以初始1μg基因组DNA所形成的噬菌斑数计算, 单位为pfu/μg pfu: phage forming unit 文库的扩增(amplification) 在LB平板上的噬菌斑中的噬菌体可溶于Phage buffer被洗回 每扩增1次, 噬菌体总数会上升100, 000倍左右 不同噬菌体个体的扩增倍数不同, 繁殖能力弱的噬菌体随着扩增轮数增多, 在总噬菌体中所占比例急剧下降, 文库代表性下降 例: 假设A1噬菌体在扩增时只能扩增10, 000倍, 而其它(A2-A100, 000)噬菌体平均扩增倍数为100, 000倍 则扩增前A1在总噬菌体中占1/100,000 扩增后占10,000/(10, 000+99, 999×100,000)=1/1,000,000 扩增后A1出现频率下降10倍 经二次扩增后则会下降100倍 用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图 确定 mRNA 没被降解 方法: mRNA的翻译 : 用体外蛋白质合成检测mRNAs 。（麦胚无细胞转译体系或兔网织细胞裂解物转译体系） 通过凝胶电泳分析mRNAs : 用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳 cDNA 文库- 检测mRNA的完整性 cDNA 的合成: 第一链 的合成: mRNA, 反转录酶，oligo(dT) ，核酸末端转移酶，dNTPs 1. oligo(dT) 引导的cDNA合成法 2. 随机引物引导的cDNA合成法 第二链的合成: 根据在第一链3’-末端加尾 （C），用补充引物合成第二链 5’ mRNA AAAAA-3’ HO-TTTTTP-5’ 5’ Reverse transcriptase Four dNTPs AAAAA-3’ TTTTTP-5’ mRNA mRNA cDNA cDNA cDNA Duplex cDNA AAAAACCC-3’ TTTTTP-5’ TTTTTP-5’ 3’ 3’-CCCCCCC Terminal transferase dCTP Alkali (hydrolyaes RNA) Purify DNA oligo(dG) Klenow polymerase 5’-pGGGG-OH 5’ 3’-CCCCCCC 5’-pGGGG 3’-CCCCCCC TTTTTP-5’ -3’ The first strand synthesis 5’-pGGGG 3’-CCCCCCC HO-CCGAATTCGGGGGG 3’-GGCTTAAGCCCCCC 5’-pAATTCGGGGGG TTTTTGGCTTAAGCC-OH CCGAATTCGG-3’ 3’-CCCC 3’-CCCCCCC 3’-CCCC 5’-pGGGG 5’-pGGGG TTTTTp-5’ -3’ TTTTTp-5’ TTTTTp-5’ -3’ -3’ TTTTTGGCTTAAp-5’ HO-CCG/AATTCGG-3’ 3’-GGCTTAA/GCC-OH CCG-3’ Duplex cDNA Single strand-specific nuclease Klenow polymerase treat with E.coRI methylase Add E.colRI linkers using T4 DNA ligase EcoRI digestion Ligate to vector and transfom Second strand synthesis 对cDNA 末端的处理 平末端的片断需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能进行克隆 步骤 : 移去突出的 3’-ends(