利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（９）：６８～７６ 利用Ｒｅｄ同源重组系统构建兔次黄嘌呤鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶基因打靶载体 １ ３ １ ２ ４ ２ 张传山　李　峰 　姚　刚 　郭　毅 　鲍柳君 　陈学进 （１新疆农业大学动物医学学院　乌鲁木齐　８３００５２　２上海交通大学医学院实验动物科学部　上海　２０００２５） （３中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所　上海　２０００９２　４苏州大学生命科学学院　苏州　２１５００６） 摘要　利用ＥＬ３５０基因工程菌进行同源重组，成功进行基因敲除已有报道，但利用该系统进行兔 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｇｕａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＨＰＲＴ）基因突 变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选到含有兔全长ＨＰＲＴ基因ＢＡＣ克隆 （ＬＢＮＬ１３０４Ｍ１９）的基础上，利用Ｒｅｄ重组系统，通过ＧａｐＲｅｐａｉｒ方式从此克隆上将一段４７ｋｂ无 启动子的 ＨＰＲＴ基因组片段 （不含有第 １个外显子）克隆到 ｐＢＡＣＬｉｎｋＳｐ质粒上，产生 ｐＢＡＣＬｉｎｋＳｐｒＨＰＲＴ质粒。然后基于ｐＢＡＣＬｉｎｋＳｐｒＨＰＲＴ质粒，设计不同的同源臂，从而删除了 ＨＰＲＴ基因的不同编码区，成功构建了三个不同的ＨＰＲＴ基因打靶载体。同时对利用同源重组技 术敲除不同大小的ＤＮＡ片段的效率进行了研究。基于实验所构建的三个不同的兔ＨＰＲＴ基因打 靶载体，为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件，及进一步获得兔ＨＰＲＴ基因敲 除动物疾病模型奠定了基础。 关键词　Ｒｅｄ重组　次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因　基因敲除　载体 中图分类号　Ｑ７８４ 　　基因敲除是自上世纪８０年代末发展起来的一种 是从头合成途径（ｄｅｎｏｖｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。二是利用腺嘌呤 新型分子生物学技术，其原理是应用外源ＤＮＡ与受体 磷酸核糖转移酶（ａｄｅｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， 细胞基因组上的同源序列之间可以发生同源重组，从 ＡＰＲＴ）及次黄 嘌呤 －鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 而使外源ＤＮＡ整合到受体细胞基因组的特定位点上， （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｇｕａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＨＰＲＴ） 实现精确、定向的基因删除或替代，而不累及其它基 的补救合成途径（ｓａｌｖａｇｅｐａｔｈｗａｙ）。ＨＰＲＴ基因突变会 ［１，２］ 导致次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖转移酶功能降低或完 因 。 ［３］ 全丧失。人体内ＨＰＲＴ功能降低，尿酸（嘌呤代谢的产 　　２００１年，Ｌｅｅ等 将基因缺陷型的 噬菌体导入 λ 大肠杆菌ＤＨ１０Ｂ，构建了一种新的具有重组功能的菌 物之一）将在体内累积，引发痛风性关节炎、肾结石和 株ＤＹ３８０（Ｒｅｄ重组系统）。在此基础上，将 Ｃｒｅ基因 膀胱结石；功能完全缺失则会导致累 －奈综合征 ［５］ （被阿拉伯糖诱导的启动子 Ｐ 严紧控制）诱导进入 （ｌｅｓｃｈｎｙｈａｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＬＮＳ） ，亦称自毁容貌症。ＬＮＳ ＢＡＤ ＤＹ３８０，产生了 ＥＬ３５０菌株（基因型为 ＤＹ３８０［（ｃｒｏ 患者还表现为神经和行为的异常，但具体原因还不清 ｂｉｏＡ ［４］ 楚。通过基因打靶技术敲除ＨＰＲＴ基因建立的雄性小 ）＜＞ａｒａＣＰ ｒｅ］） 。 ＢＡＤＣ 　　哺乳动物体内嘌呤核苷酸的合成有两条途径。一 鼠ＬＮＳ疾病模