医学分子生物学 第三部分 基因诊断与基因治疗.pptVIP

第三部分 基因诊断与基因治疗 一、基因诊断的概念 基因诊断：它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因（内源、外源）的存在、缺陷或表达异常，对人的状态和疾病作出诊断的方法和过程。 基因诊断的特点 特异性强，可对患者作出诊断，可检测致病基因的携带者，某些基因的易感者。 杂交技术和PCR技术具有放大效应，灵敏度高。 可用于产前诊断，和对特定人群的大规模普查和筛查。 检测样品不受组织和时相限制。 可检测自体基因或外源基因，适合多种疾病的诊断。 二、基因诊断技术平台 （一）核酸分子杂交 1. 探针 （1）DNA探针 （2）RNA探针 2. 杂交技术 （1） southern杂交： 限制性内切酶消化DNA→琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段→转印到NC膜或尼龙膜→碱变性、中和→预杂交、杂交→放射性自显影 （2）northern杂交 （3） dot blotting 斑点杂交 1981 Dot blot和Slot blot:将DNA或RNA不经消化和电泳，变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性定量研究. 反向斑点杂交 组织原位杂交  tissue in situ hybridization 把组织或细胞样品适当处理，使其通透性增强，使探针进入细胞内与核酸杂交。样品可以是组织切片、石蜡切片、细胞涂片。 原位杂交可以确定被检核酸在组织和细胞中的定位，不必提DNA。 PCR技术和其他技术联合使用 PCR－RFLP Restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性 PCR－ASO allele-specific oligonucleotide 等位基因特异性寡核苷酸杂交 PCR－SSCP （single-strand conformation polymorphism analysis,SSCP) 单链构象多态性分析 DNA测序 DNA芯片 基础：反向点杂交 特点：高通量 三、常见的基因异常及其检测 （一）检测基因结构异常： 1. 点突变的检测（少量 nt 缺失和插入） 已知点突变、 未知点突变 2. 大片段的缺失（或插入） 3. 基因重排和移位的检测 4. 基因扩增的检测 5. DNA多态性的检测 1 点突变的检测（少量nt缺失和插入） 已知点突变 ① PCR – ASO 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法： (a11ele-specific oligonucleotide hybridization, ASO) 设计ODN探针， 一般合成2个寡核苷酸探针，分别与野生型基因、突变型基因序列互补。　 　 提DNA样品，点样，变性、杂交，严谨条件下洗膜。 分析： 正常序列―正常探针杂交 变异序列―异常探针杂交 两个探针均能够杂交―杂合子，表明同时具有正常序列和变异顺序。 PCR-ASO ② 如突变发生在限制性内切酶的识别位点上，则产生限制酶片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphisms, RFLP） 序列多态性:?限制酶酶切位点的多态性  DNA 酶切 电泳 分析 例：Lener视神经病，11778位G A，使SfaN 1酶切点丧失。 DNA PCR SfaN 1酶切 电泳 分析 正常： 190bp, 150bp 杂合子： 190bp, 150bp， 340bp 纯合子： 340bp ③ 引物特异 PCR 等位基因特异性扩增 (allele specific amplification，ASA) 根据已知突变位点，在引物3’端设计一个错配碱基，使之只与突变型或野生型DNA互补，只扩增突变型或野生型基因。 ? 正常引物，异常引物 PCR　　电泳 分析 ④ PCR－测序（检测单点突变、多点突变） 2、未知点突变的检测 及少数nt缺失或插入： PCR-SSCP