黑腹果蝇DOA蛋白激酶与底物eEF1Bγ和SRm160相互作用的研究.pdfVIP

摘 要 Darkener 因其在哺乳动物存在4 ofapricot(Doa)是果蝇基因组中编码LAMMER激酶的唯一位点。 是它可能磷酸化SR和类SR蛋白，通过调控果蝇体细胞性别决定信号通路中关键因子doublesex 的选择性剪接，从而控制果蝇的性别分化。本研究确定了eEFl By和SRml60为DOA激酶的磷酸 化底物，并进一步研究这两种蛋白与DOA蛋白激酶的相互作用及在其果蝇发育中的作用，扩充了 I_AMMER激酶参与调控的生理功能。 通过酵母双杂交，发现果蝇eEFl By(翻译延长因子1By)与DOA激酶存在相互作用。关于eEFlBy 基因的研究主要集中在低等生物，在果蝇及更高等的真核生物中，未见相关研究。果蝇eEFIBy蛋 白C端的丝氨酸2舛极为保守，可能是LAMMER激酶的磷酸化位点。进一步研究发现在体外和体内 实验中eEFlBy都能够被LAMMER激酶磷酸化，并通过点突变的方法确定了该磷酸化位点。本研究 通过免疫荧光组化的方法确定该蛋白在果蝇胚胎发育中的表达及分布情况，并在蛹期的细胞核提取 物中检测到该蛋自的存在。该位点的无义突变造成果蝇隐性致死，说明eEFlBy蛋自在果蝇中担负 重要的生理功能。为了进一步揭示eEFlBy中DOA磷酸化的作用，我们构建了野生型载体和磷酸化 位点被突变的突变载体，结果证实该磷酸化位点的缺失降低了蛋白的活性，因为诱导转化的野生型 基因位点表达可以逆转内在的纯合无义等位基因的致死性，而该磷酸化位点突变后，诱导表达的蛋 白只能在一定程度上逆转致死性。 原位杂交和免疫组化的方法，研究了SRml60mRNA和蛋白质在胚胎中的表达及分布。SRml60基 因活性的丧失及高表达对果蝇都具致死性。另外器官特异性的诱导SRml60高表达与RNAi导致多 种的器官的发育异常。高表达SRml60导致果蝇复眼结构严重异常和雄性生殖器结构异常或完全缺 失雄性生殖器和肛门。而DOA位点的突变抑制高表达在复眼中导致的突变表型，但增强在生殖器中 高表达导致的表型，该结果显示在不同器官中，不同的信号通路参与SRml60和DOA的相互作用。 此外，Doa突变可以造成雌果蝇出现不同程度的雄性化特征，而SRml60无义突变基因增强Doa突 变诱导的这种性别逆转表型。该结果表明SRml60可能也是DOA激酶的底物并参与果蝇体细胞性 别决定的信号通路。我们的研究结果表明Doa和SRml60基因之前存在密切的遗传上的相互作用， 这说明SRml60是一个DOA激酶的作用底物。为了确切阐明二者间的相互作用机制，还需要进一 步通过生物化学和分子生物学的手段进行更深入的研究。 关键词：果蝇，LAMMER蛋白激酶，Doa，eEFIBy,SRml60 Abstract TheDarkenerof the locus LAMM apricot(Doa)isunique encodingERkinaseinDrosophila． LAMMERkinaseisalso knownasCLKforits4 mammals．Thebest paralogues(CLKl-4)in studiedroleofLAMMERkinasesisthatit theSRandSR—like and phqsphorylate proteins the alternativeeventsinsomaticsex—determinationin subsequentlyregulate splicing pathway this identifiedeEFl SRml60asthesubstratesofDOA Drosophila．Instudy,we