同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌质粒bla基因-检验医学.PDFVIP

检验医学２０１４年６月第２９卷第６期　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｕｎｅ２０１４，Ｖｏｌ２９．Ｎｏ６． ·６０３· 文章编号：１６７３８６４０（２０１４）０６０６０３０４　　中图分类号：Ｒ４４６．５　　文献标志码：Ａ　　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３８６４０．２０１４．０６．００６ 同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌质粒ｂｌａ 基因 ＫＰＣ２ 仉　英，　田月如，　艾芙琪，　刘　红，　马逸珉，　王　蓓，　蒋晓飞 （复旦大学附属华山医院检验科，上海２０００４０） 　　摘要：目的　建立敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株质粒上的耐药基因的方法。方法　聚合酶链反应（ＰＣＲ） 分别扩增试验菌株待敲除目的基因ｂｌａ 的上下游片段及质粒ｐＭＱ３００的潮霉素耐药基因片段，采用重叠延伸 ＫＰＣ２ 基因扩增（ＳＯＥＰＣＲ）技术构建融合片段，以耐阿普霉素的 ｒｅｄ质粒ｐＫＯＢＥＧＡｐｒ为介导，同源重组敲除临床肺 λ 炎克雷伯菌耐药菌株的ｂｌａ 基因。用含潮霉素和阿普霉素的ＬＢ培养基筛选重组子，用ＰＣＲ和逆转录ＰＣＲ扩 ＫＰＣ２ 增检测ｂｌａ 基因、潮霉素耐药基因及药物敏感性验证重组子。结果　不同多位点序列分析（ＭＬＳＴ）型别的２ ＫＰＣ２ 株临床肺炎克雷伯菌耐药菌株的ｂｌａ 基因得以敲除。结论　 ｒｅｄ同源重组法可以可靠敲除临床肺炎克雷伯 ＫＰＣ２ λ 菌耐药菌株质粒上的基因。 关键词：基因敲除；同源重组；肺炎克雷伯菌 　　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｋｎｏｃｋｏｕｔｂｌａ ｇｅｎｅｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ， ＫＰＣ２ ＴＩＡＮＹｕｅｒｕ，ＡＩＦｕｑｉ，ＬＩＵＨｏｎｇ，ＭＡＹｉｍｉｎ，ＷＡＮＧＢｅｉ，ＪＩＡＮＧＸｉａｏｆｅｉ．　（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＨｕａｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００４０，Ｃｈｉｎａ） 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｏｆｋｎｏｃｋｉｎｇｏｕｔｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓｏｎｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｔａｉｎｅｄｂｙｃｌｉｎｉｃａｌ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍａｎｄｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｂｌａ ｏｆｔｈｅｔｅｓｔｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓ ＫＰＣ２ ｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＭＱ３００，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＳＯＥＰＣＲ）ｗａｓｕｓｅｄ ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｆｕｓｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓ，ａｎｄａｐｒａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｌａｍｂｄａｒｅｄｐｌａｓｍｉｄｐＫＯＢＥＧＡｐｒｗａｓｕｓｅｄａｓｍｅｄｉａｔｅｄ， ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｋｎｏｃｋｏｕｔｂｌａ 　ｇｅｎｅｉｎｃｌｉｎｉｃａｌＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｄｒｕｇｒｅｓ