第十二章节实验动物胚胎工程技术课件.pptVIP

3.带有外源基因的体细胞通过克隆技术进入胚胎 将带有外源基因的体细胞作为供体，通过核移植技术克隆到去核卵母细胞，在体外发育成囊胚，再移植到假孕动物的子宫中。出生后动物的基因型与供体的基因型完全一致。 外源基因 早期胚胎 显微注射法 逆转录病毒法 外源基因 ES细胞 体细胞 电穿孔法 脂质体法 嵌合体动物 克隆动物 嵌合体技术 体细胞移植技术 外源基因进入胚胎的几条途径 外源基因进入细胞后的命运 外源DNA进入细胞后有三种命运： 1．被胞内酶降解。 2．以游离状态存在。游离的未整合外源DNA只要有真核细胞能识别的启动子、编码基因以及poly(A)信号等，一般都能得到表达，但随着细胞衰老，表达力下降。这种表达不能传代，称为暂时表达。 3．整合到受体细胞染色体（只有少数）。整合到受体细胞基因组的外源基因，能随细胞分裂遗传到子细胞，称为稳定表达。 DNA构件导入细胞后可能的整合方式 显微注射法 逆转录病毒感染 精子介导转基因 电穿孔 电穿孔 脂质体转染 磷酸钙转染 生殖细胞或早期胚胎 ES细胞 体细胞 随机整合 定点整合或随机整合 定点整合或 随机整合 外源基因整合到受体细胞染色体可分为以下两种情况： ① 随机整合（Random integration ）：外源基因进入细胞后，随机插入到任意的染色体内。如果插入到一个基因内，可能导致该基因的失活。另外，插入外源基因受邻近调控序列的影响，其表达可能高，也可能低。 ② 定点整合（Targeted integration）：实现定点整合的前提是外源基因的一端或两端带有定点整合部位的同源DNA序列，即所谓的同源臂（Homologous arm）。当外源基因载体进入细胞后，同源臂序列与宿主染色体上的相同序列相互靠近，通过同源重组，将外源基因载体置换到染色体相应的位置上，实现了定点整合。我们把这种技术形象地称之为“基因打靶”。 随机整合（Random insertion） 外源基因随机插入到染色体的任意部位。 插入到致死基因序列内：胚胎死亡 插入到功能基因序列内：基因失活 插入到调控区下游：外源基因表达增强/减弱 定点整合（targeted integration） 同义词：基因打靶（Gene targeting） 是指将基因组的某一基因序列克隆出来并加以改造，再导入同种细胞内。该基因序列可以与细胞基因组内的同源序列（靶基因）发生重组，从而将改造后的基因置换到基因组内，实现靶基因敲除、替换或改造。 同源重组（Homologous recombination） 是指发生在DNA同源序列之间的重组，其条件是两条DNA分子有相同序列部分，并且互相接近。 1 neo tk 3 1 2 3 1 neo 3 载体 基因组 位 点 定位整合 位 点 如何在体外筛选定点整合的供体细胞和ES细胞？ 采用正负筛选法 正筛选：用Neor基因（新霉素抗性基因） 杀死没有Neor基因的细胞 负筛选：用tk基因（ HSV胸腺激酶基因） 有tk基因的细胞可使培养液中 的Ganc转变成一种有毒物质使 细胞死亡。 对通过正负筛选法筛选存活的细胞进行分子生物学鉴定，筛选出定点整合的细胞。 用正负筛选法筛选定点整合细胞 正筛选用Neor基因：新霉素抗性基因 当带有Neor基因的打靶载体转染细胞，未整合Neor基因的细胞被培养液中的G418（新霉素的衍生物）杀死，而整合到宿主细胞的Neor基因对培养液中的G418产生耐药性，存活下来形成细胞克隆。但是存活的细胞克隆只能证明是整合了Neor基因，而不能区分是随机整合还是定点整合。 正常细胞 细胞死亡 定点整合 细胞存活 随机插入 细胞存活 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 G418培养液 正常细胞 细胞存活 定点整合 细胞存活 随机插入 细胞死亡 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 GANC培养液 负筛选用tk基因：HSV胸腺激酶基因 HSV-tk+基因产物可使培养液中的Ganc转变成一种有毒物质使细胞死亡。如果发生随机整合，tk基因的作用是细胞死亡。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，断裂脱落，因而对细胞没有影响。 这样受体细胞抗G418有正选择作用，对Ganc无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的。 经过正负筛选后存活的细胞克隆是否是定点整合的细胞，还需要用分子生物学方法（Southern 印迹法）进行鉴定。 正常胎儿成纤维细胞 G418和GANC正负筛选后形成的细胞克隆 随机整合和定点整合的不同点 随