8组织培养第八章　原生质体培养PPT.ppt

第八章 原生质体培养 宜职院08.9 ;目的与要求 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。 具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。; ;;;;叶肉原生质体分离纯化;纯化后的叶肉原生质体;;;原生质体培养程序示意图; ;2、平板法培养 原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合—置于6cm培养皿（2-3mm）,暗培养—5-7天原生质体开始分裂 特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系，可定位观察。原生质体易受热伤害，易破碎，原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。 ;3、悬滴法培养 将含一定密度原生质体的悬浮液，滴在6cm培养皿盖内侧上，皿底加入培养液和渗透剂等液体保湿，此时培养小滴悬挂在皿盖内。 特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。;4、双层培养法 固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。 特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎。 ;5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。 特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。;;;三、培养条件 25-27℃，光照16h/d，最初几天经常摇动，以助透气。四、原生质体存活率、密度及产量的测定（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100%（二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）×104×稀释倍数;（三）原生质体产量的测定 Y=DV / FW Y（个/g）——原生质体产量 D（个/ml）——存活原生质体密度 V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积 FW（g）——制备原生质体所用材料的鲜重; 第三节 原生质体融合 也称体细胞杂交，就是分离下来的不同亲本杂交的原生质体，在人工控制下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。 自然条件下，原生质体自然融合频率极低，必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。;;甘薯原生质体融合植株;二、原生质体融合的方法和过程（一）无机盐诱导融合 硝酸钠（二）聚乙二醇（PEG）诱导剂与高钙相结合的诱导融合 1、PEG诱导剂溶液配制：分子量为4000-6000。 2、高Ca2+-高PH液 3、原生质体培养基：NT与MS;4、融合过程 （1）收集原生质体 （2）滴150ul混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层。 （3）吸取PEG融合诱导液450u ,使PEG溶液逐渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连。 （4）保温后，取高Ca2+-高PH溶液0.5ml，滴入原生质体悬浮液与PEG混合液中。;（5）吸取2ml原生质体培养基洗涤PEG处理过的原生质体5次。 （6）在载玻片上的材料上，加上一层原生质体生长所须的培养基 （7）融合百分率计算 融合百分率=融合数目/两亲本原生质体总数×100%;完整洋葱原生质体（40×）;;（三）电融合技术 1、将原生质体悬浮液离心，去上清，用电击液（10%甘露醇，0.1mmol/L醋酸钙，0.5mmol/L醋酸镁） 2、对电融合仪的交变电场频率，高压方波幅值和持续时间、次数、间隔时间进行预先设置试验。 3、取1-2滴悬浮液与电融合仪极间。 4、1-2min后，给予瞬间的高度电脉冲。;;;;三、杂种细胞的筛选与鉴定 （一）互补筛选 1、白化互补选择法 2、营养缺陷型互补选择 3、抗性互补选择 4、代谢互补仰制选择 （二）机械分离杂种细胞法法 （三）双荧光标记选择法;双荧光素标记;作业： 1、说明机械分离法和酶分离法的特点 2、原生质体纯化方法有