微生物遗传-10-育种A.ppt

第三章 微生物育种 主要内容 微生物资源 如何分离纯化和鉴别 如何保藏微生物 如何筛选和改造 微生物工程的主要环节 菌种 发酵工艺 后处理 筛选改造菌种的机制和技术 自发突变 诱变 重组 同源重组、转座子、噬菌体 基因工程 DNA改组技术 菌种的筛选及改造 常用的诱变技术 紫外诱变、化学诱变剂、红外、超声波等诱变技术 定向筛选技术 随机诱变，定向筛选 菌种的定向改造（代谢工程） 代谢工程就是用DNA重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成和细胞的性能的学科。 1、微生物资源 微生物的多样性 微生物的生境：土壤、水域、动物、植物、极端环境、特殊环境、大气 多样性的广度：地球上原核生物的碳含量和磷含量约为植物的10倍 可培养微生物的比例：海水0.001-0.1%，淡水：0.25%，土壤：0.3% 极端环境微生物 国内菌种保藏中心 CGMCC：中国普通微生物保藏中心 CMCC：中国医学微生物保藏中心 ACCC：中国农业微生物保藏中心 GBCAS：中科院基因库 2、如何分离纯化和鉴别 2.1 菌种鉴定技术 2.2 DNA指纹技术 2.3 富集培养技术 2.1 菌种鉴定 1980年代之前，细菌的分类和鉴定主要依靠形态学特征、培养特征、生理生化特征和免疫学反应进行。这些方法在细菌分类鉴定中发挥过重要作用，也存在着鉴定准确性差、繁琐耗时等缺点。 随着分子生物学的飞速发展，特别是聚合酶链式反应技术(PCR)的发明，细菌的分类鉴定发生了重大革新，开始进入分子水平，一批分子鉴定方法也随之产生。其中16S rDNA基因的同源性分析已经成为细菌种属鉴定的标准方法，在细菌的分类研究中起着重要的作用 。 细菌的鉴定 细菌种属鉴定一般采用形态学观察作初步鉴定，包括革兰氏染色、夹膜、鞭毛、运动性观察等。 然后进行生理生化实验做进一步鉴定，包括厌氧、好氧实验，完全培养基和基本培养基培养实验，降解性实验等系统的生理生化实验研究。 最后进行16srDNA序列扩增测序，将测到的序列与Genebank中已知的细菌序列相比较，根据亲缘关系远近最终确定种属。一般来说，90％以上的同源性就可以确定到属，确定到种的可能性很小。 特定蛋白的序列比对，绘制进化树 什么是 16S rRNA/DNA? 是16S rRNA的编码基因 原核生物核糖体由蛋白质和三个核糖核酸组成: 5S rRNA (120 base pairs), 16S rRNA (1540bp), 23S rRNA (2900bp). 16S rRNA 序列由交替的稳定区和可变区组成（conserved and variable regions） 16S rRNA中有九个可变区 16S rDNA基因 它由保守区和可变区组成，保守区为所有细菌所共有，细菌间没有差别；可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性。 细菌的16S rDNA序列长约1．6kb左右，其序列变化速度与进化速率相适应，因此被广泛用于种属鉴定。结合完善的数据库，16S rDNA序列分析可以快速准确的对微生物进行种属鉴定，确定微生物在进化中的位置。 结合功能性基因的特殊序列，可以在混合菌种的样品中，检测目的菌种的存在。 根据16SrDNA序列同源性分析建立细菌系统发育分类的准确性和重要性已经被越来越多的细菌分类学者所认识和接受 16S rDNA鉴定菌种 提取细菌基因组，用通用引物将细菌16S rDNA序列扩增出来，长度1.5k左右 然后将序列送至基因库中进行比对，同源性最高，且至少达到97％以上可认为是同一种。 也可以将序列下载后用比对软件进行生物进化分析，可以看到与各菌种间亲缘关系。 2.2 DNA指纹技术 2.2.1 RFLP技术 RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。 2.2.2 RAPD分析 运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。 该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 微卫星DNA标记技术（SSR） 2.3 富集培养 生境样品→→富集培养→→