扩增后CD34ltgt细胞在NODSCID小鼠体内的造血重建实验研究.pdfVIP

文章范围：1.6 基因工程与组织工程 联系电话：021 通信地址：上海市梅陇路130 号华东理工大学309 信箱杨施 E-mail ：yangshi_526@ + 扩增后CD34 细胞在NOD/SCID 小鼠体内的造血重建实验 杨施， 蔡海波， 谭文松 （华东理工大学国家重点实验室，上海，200237 ） 摘要：体外培养的CD34+细胞其生理功能是否发生改变，是干细胞领域关注的一个热点问题。 NOD/SCID 小鼠体内造血重建实验是目前评价造血干细胞生理功能最直接可靠的方法。本实 验采用FL+TPO+ SCF+IL-3+IL-6 、SCF+IL-3+IL-6 两种细胞因子组合体外培养脐血单个核细 胞，7 天后收集CD34+细胞，并以不同剂量分别植入经半致死剂量放射照射的NOD/SCID 小 鼠中，饲养6 周后，通过检测小鼠骨髓、脾脏及外周血中各类人源造血细胞的含量，检测小 鼠骨髓中人源基因序列，证实植入的细胞具有在小鼠体内重建造血的功能，同时细胞核型分 析结果表明培养过的细胞染色体没有发生畸变。 关键词： 造血干细胞，体外培养，造血重建，NOD/SCID 小鼠 20 世纪90 年代以来，造血干细胞移植技术飞速进展，已成为治疗多种恶性疾病的重要 手段。尤其是脐血造血干细胞移植，由于脐血作为造血干细胞来源有很多优点如原始干/祖 细胞的比例较骨髓和动员外周血高、GVHD 发生率低、来源广泛、采集方便等，在临床上 具有广阔的应用前景[1,2] 。但是由于脐血造血干/祖细胞数量有限，限制了其应用范围。体外 扩增技术可以解决这一难题。然而，体外扩增后的造血干细胞其原有的生理功能是否会发生 改变，是必须探明的一个问题。动物体内长期多系造血重建实验是目前判断造血干细胞最直 [3] 。NOD/SCID 接可靠的方法，即免疫缺陷小鼠重建细胞（SCID-repopulating cell, SRC）评价 小鼠是一种无T 和B 淋巴细胞功能，又有先天免疫缺陷的动物模型，其骨髓造血微环境及 造血基质完整无损，故能支持异基因造血干/祖细胞的植入和生长[4] 。本实验将以脐血单个 核细胞（MNC ）起始进行培养，分离扩增后CD34+细胞，输注入NOD/SCID 小鼠中，采用 流式细胞术以及体外集落形成分析法分析小鼠长期造血重建情况，评价培养后造血干细胞的 功能。 1 材料与方法 1.1 脐血来源与脐血单个核细胞( MNC )的分离 脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求是身体健康、发育良好的非高龄产妇。 脐血经淋巴细胞分离液梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM 培养基洗涤两次后备用。 1.2 脐血单个核细胞体外培养与CD34+细胞的纯化 体外培养基本培养基用IMDM （Gibico ），使用时添加20 ％胎牛血清，采用两种细胞因 子组合。第一组为SCF+IL-3+IL-6，其浓度分别为：50 ng/mL、5 ng/mL和20ng/mL 。另一组 在第一组基础上添加FL和TPO ，其浓度分别为：50 ng/mL和20ng/mL 。细胞培养在37℃、 6 5%CO2湿度饱和的二氧化碳培养箱中进行，MNC 以1×10 cells/mL密度接种于24孔板，每孔 2mL ，当培养至第4天时半量稀释换液（即取出一半的培养基和细胞，补加相同体积的新鲜 培养基和细胞因子) 。 细胞培养至7天后，采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置进行CD34+细胞的纯化，按 + + 照CD34 细胞选择试剂盒（Milienyi Biotech ）说明书进行操作即获得纯化的CD34 细胞。 1.3 造血细胞的集落检测 集落检测体系为IMDM培养基，添加20 ％胎牛血清（FBS ），含0.9 ％甲基纤维素(Sigma) 以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6 ，GM-CSF、G-CSF、EPO 。半固体培养在24孔板