扣囊复膜孢酵母β葡萄糖苷酶基因在工业酿酒酵母的表达研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨话奇论文集 扣囊复膜孢酵母p葡萄糖苷酶基因在 工业酿酒酵母的表达 周衍，张梁，王正祥，石贵阳 (扛南大学生物工程学院．玉镑214036) 摘要：奉文呆用耆有潮霉素B选择性标记的pRS41H质粒为载体．在工业酿酒酵母自身 的gpd2启动子．终止子下，使扣囊复膜孢酵母的}葡萄糖苷醇(bgl基因)在工业酿酒酵母中 进行表达．在潮霉素B500u酬的培养基上挑选、得到重组子S．cere。isiaeBGL，可以在以 纤维二糖为唯一碳源的培养基上生长，并且36h时．测得最高癣活，8．18u／ml。在纤维二糖 为唯一碳源的酒精发酵中，发酵12h时酒精度达到0．015％。 关键词：工业酿酒酵母；B_葡萄糖苷酶f潮霉素B 前言 乙醇广泛应用于人们生活的各个方面。有着巨大的需求量。特别是石油危机的爆 发，使发酵法生产燃料酒精进入了大发展时期o】。 淀粉质原料的浓醪酒精发酵工艺中，纤维二糖是存在于酒糟中未能在发酵过程中被 酿酒酵母有效利用的最主要的还原糖之一D]。酵母充分利用酒糟中的残糖对降低酒精 生产成本和减轻酒精工业对环境的压力具有重要意义。 纤维二糖的有效水解需要口一葡萄糖苷酶的作用。一分子的纤维二糖在口一葡萄糖苷 酶的作用下直接转化为两分子的葡萄糖，从而可被酵母利用。 在工业酿酒酵母中要表达一段外源基因，必须要有适当的启动子和选择性标记。酵 母启动子分两大类：第一类是来自编码解糖两基因的解糖启动子，如ADHI、PGK，GAP、 ENoI等，这些启动子能在酵母茵中高水平组成型表达；第二类是强调节启动子，其中 体，所以几乎不能选用营养缺陷标记，一般多选用药物选择性标记，如潮霉素B和艮他霉 素(G418)[3]。 ’ ’ 1材料与方法 ‘ 1．1菌株与质粒 酒精工业发酵酵母Y(S．cerevisiaeY)为生物资源研究室保藏；扣囊复膜孢酵母 作者简介：石贵阳，男，1963年生，博士，教授，E--mail：gyshi@sytu．edu．cn． 第四次全国发酵工程学术讨论会 erichiacoli 惠赠；其他重组质粒在本实验中构建。 1．2培养基、工具酶和试剂 1．2．1培养基 7．0；用于大肠 LB培养基：胰蛋白胨109，酵母提取物59，氯化钠109，定容至1L，pH 杆菌培养。固体培养基添加1．5％琼脂。挑转化子时，加入10099／mL氨苄青霉素。 于重组于的筛选。 扣囊复膜孢酵母生长培养基：用12度的麦芽汁．固体培养基添加1一％琼脂，8磅30 分钟灭菌。 1．2．2工具酶和药品 碱性磷酸酶(CIAP)、T4DNA连接酶和限制性内切酶等为晶美生物工程有限公司产 品；k--EcoTl4I 剂盒为上海申能博彩生物技术有限公司产品；引物由上海生工生物工程公司合成。 1．3质粒构建 提取扣囊复膜孢酵母染色体，PCR扩增，得到编码}葡萄糖苷酶的bgl目的基因片 断。该片断只含有信号肽．不含有启动子基因片断。pRS41H质粒也只有选择性标记 终止子，在引入一个启动子的同时，也有利于后续的整合、基因敲除实验的进行。 引物： 1 TAAGGATCCATGTAATAAGCAAACAAGCACGAATG 2 ATAATTACCGGAATTCTGATAAGGAAGGGGAGCG 3 ATACCATGGAGGCCTAGACCTTACTTCCACGTCAA 4 TCTGCATGTGATTAT TTAGGATCCTCGTCAACTTC 5 CCGGAATTCATGTTGATGATAGTACAGCTTTTGG 6 ATGCCATGGGGAAAAATCAACGTCATA