糖化血红蛋白检验.docVIP

精品论文 参考文献 糖化血红蛋白检验 张艳影 杨 静 (哈尔滨市红十字中心医院 150010) 【中图分类号】R185 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)35-0421-02 【关键词】 糖化血红蛋白 血糖 检验 (一)离子交换层析法 1.原理 用偏酸缓冲剂处理Bio-Rex70阳离子交换树脂，使之带负电荷。它与带正电荷的Hb有亲和力。HbA及HbA，均带正电荷，由于HbA1的两个beta;-链N-末端正电荷被糖基清除，正电荷较HbA少，两者对树脂的附着力不同。用pH6.7磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较弱的HbA1洗脱下来，用分光光度计测定洗脱液中的HbA1占总Hb的百分数。 2.试剂 (1)0.2 mol／L磷酸氢二钠溶液：称取无水Na2HPO428.396 g，溶于蒸馏水中，并加蒸馏水至1 L(即试剂1)。 (2)0.2 mol／L磷酸二氢钠溶液：称取NaH2PO4?2H2O31.206 g，溶于蒸馏水中，并加蒸馏水至1 L(即试剂2)。 (3)溶血剂：pH 4.62，取25 ml试剂2，加0.2 ml Triton X-100，加蒸馏水至100 ml。 (4)洗脱剂I(磷酸盐缓冲液，pH 6.7)：取100 ml试剂 1150 ml试剂2于1 000 ml容量瓶内，加蒸馏水至1 L。 (5)洗脱剂Ⅱ(磷酸盐缓冲液pH 6.4)：取300 ml试剂1及700 ml试剂2，加蒸馏水300 ml，混匀即成。 (6)Bio-Rex70阳离子交换树脂，200～400目，钠型，分析纯级。 3.操作 (1)树脂处理：称取Bio-Rex70阳离子交换树脂10g，加 0.1 mol／L NaOH溶液30 ml，搅匀，置室温30分钟，期间搅拌2～3次。然后加浓盐酸数滴，调至pH 6.7，弃去上清液，用约50 ml蒸馏水洗1次，用洗脱剂Ⅱ洗2次，再用洗脱剂I洗4次即可。 (2)装柱：将上述处理过的树脂加洗脱剂I，搅匀，用毛细滴管吸取树脂，加入塑料微柱内，使树脂床高度达30～40 mm，树脂床填充应均匀，无气泡、无断层。 (3)溶血液的制备：将EDTA抗凝血或毛细管血20mu;l，加于2.0 ml生理盐水中，摇匀并离心，弃去上清液，仅留下红细胞，加溶血剂0.3 ml，摇匀，置37℃水浴中15分钟，以除去不稳定的 HbAl。 (4)柱的准备：将微柱颠倒摇动，使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入15 mmtimes;150 mm的大试管中，让柱内缓冲液完全流出。 (5)上样：用微量加样器取100mu;l溶血液，加于微柱内树脂床上，待溶血液完全进入树脂床后，将柱移人另一支15 mmtimes;150 m洁净的空试管中。 (6)层析洗脱：取3.0 ml洗脱剂I，缓缓加于树脂床上，注意勿冲动树脂，收集流出物，此即为HbA1(测定管)。 (7)对照管：取上述溶血液50mu;l，加蒸馏水7.5 ml摇匀，此即为总Hb管。 (8)比色：用分光光度计，波长415 nm，比色杯光径10 mm，以蒸馏水作空白，测定各管吸光度。 (9)微柱的清洗和保存：用过的柱先加洗脱剂Ⅱ 3.0 ml，使Hb全部洗下，再用洗脱剂I洗3次，每次3.0 ml，最后加洗脱剂I 3.0 ml，加上下盖，保存备用。 4.计算 HbA1(％)=测定管A／(对照管Atimes;5)times;100％。 5.参考值成人HbA1(％)：均值6.5％；范围5.0％～8.0％。 (二)亲和层析法 1.原理 用于分离糖化与非糖化Hb的亲和层析凝胶柱，是交联间-氨基苯硼酸的琼脂糖珠。2.试剂 (1)洗涤缓冲剂(wash brffer，WB)：含250 mmol/L醋酸铵、50 mmol/L氯化镁、200 mg／L叠氮钠，调节至pH 8.0，贮于室温。 (2)洗脱缓冲剂(elution buffer，EB)：含200 mmol／L山梨醇、100 mmol／L Tris、200 mg/L叠氮钠，调节至pH 8.5，贮于室温。 (3)0.1 mol／L及1 mol／／L盐酸溶液。 3.操作 (1)标本采集：EDTA或肝素抗凝，静脉采血，充分混匀后置4℃可保存1周。 (2)溶血液的制备：将抗凝