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实验三 鞭毛染色法及活细菌  运动性的观察 一、实验目的： 1.学习细菌的鞭毛染色法,观察细菌鞭毛的形态特征; 2.学习用悬滴法观察细菌的运动性. 二、实验原理： 细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 二、实验原理： 细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。 大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。 三、实验器材 1. 活材料：培养12-16h小时的普通变形杆菌）。 2. 标本片：单鞭毛（绿脓杆菌），周鞭毛（伤寒杆菌）） 3. 试剂：生理盐水、香柏油、二甲苯。 4. 器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、吸水纸、接种环，显微镜等。 四、实验方法 （一）鞭毛染色 硝酸银染色法： 1.清洗玻片：选择光滑无裂痕的玻片，最好选用 新的。然后将玻片置洗衣粉过滤液中 （洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）， 煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾 干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出 玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将 水沥干后，放入95%乙醇中脱水。 2. 菌液的制备：菌龄较老的细菌容易失落 鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的 牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3-5代， 以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱 中培养12—16h。 3. 制片： 载片上滴一滴蒸馏水→菌种斜面的冷凝水处取一环菌 →在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下→将载片稍倾斜，使菌液散开即可（切勿涂抹）→自然风干→ 固定。 4、 硝酸银染色： A染液（媒染剂）染色4-6分钟→蒸馏水洗→ 再用B染液（硝酸银）冲洗残水→ 然后使B液充满载片→ 酒精灯加热至冒气（微热），30-60秒（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）→蒸馏水洗、自然干燥→ 镜检. ①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。 ②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；否则鞭毛易脱落，造成染色失败。 ③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。 ④A、 B染液染完后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。 ⑤加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽，染色效果较不加热为好。 染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。 （二）细菌的运动性观察 悬滴法： 1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4滴生理盐水，制成轻度混浊的菌悬液。 2.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，也可用接种环挑取一环菌液于玻片中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。 3.盖凹玻片：? 将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液， 并轻轻地盖在盖玻片上，然后翻转凹玻片， 使菌液正好悬在凹槽的中央。 4.镜检：? 先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可 找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。 注意事项 1、检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动。 2、制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。 3、若使用油镜观察，应在盖玻片上加香柏油一滴。 五、实验作业： 1. 绘出鞭毛菌（绿脓和伤寒杆菌）的形态图. 2. 用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？ 3. 悬滴法中，为什么加的菌液不能大多？如果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向流动，你认为是什么原因造成的？ 下周实验 四大类微生物菌落及个体形