分子生物学其它试验技术.docVIP

第七章 分子生物学其它实验技术 实验一 M13克隆和DNA序列分析 一、原理和用途 DNA的序列分析是DNA分子克隆研究中最重要的方法之一，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片段的操作方面，都有着十分广泛的实用价值。根据DNA序列，可以得知限制性酶切位点；可以了解蛋白质的编码区和上、下游调控序列，进而研究编码基因的表达；可以确定基因诱变后特异的碱基变化；在疾病基因诊断中，可提示疾病的分子缺陷，并确认某个位置的碱基突变，从而找出疾病发生的机制。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学修饰法。这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、 G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前应用广泛的是M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法。 M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）测序法的基本原理是：M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染新的宿主菌。把一段待测DNA用遗传工程方法插入双链的M13复制型DNA中，经过培养扩增，在培养物的上清液中可以提取到单链的M13噬菌体的DNA。该单链DNA已含有插入待测DNA的序列，作为单链模板。在待测DNA的3′端人工合成一段引物，在DNA聚合酶I作用下，复制链延长。2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）掺入到核苷酸生长末端，取代了脱氧核苷（dNTP）之后，由于ddNTP没有3’-OH基团，所以核苷酸链就不再能够继续延长（终止了链的合成），这种复制延长的终止是随机的，于是形成分子量、长度、大小不等的片段。然后再电泳分离，自显影，读图分析碱基序列。例如在同一个反应试管中，加入同一种DNA合成的引物和模板，DNA聚合酶，ddTTP，dTTP，以及其它3种脱氧核苷三磷酸 （dATP、dGTP和dCTP），其中dATP是带32P放射性标记的，那么经过适当的温育之后，将会产生出不同长度的DNA片段混合物。它们全都具有同样的5’-末端，并在3’末端的ddTTP处终止。将这种混合物，加到变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，就可以获得一系列全都以 3’-末端ddTTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。使用其它核苷酸的抑制物，如 ddATP，ddCTP，ddGTP，并分别在不同反应试管中温育，然后连同第一个ddTTP反应，平行加到同一变性凝胶上作电泳分离，最后再通过放射自显影技术，检测单链DNA片段的放射性条带。结果可以从放射性X光片上，直接读出DNA的核苷酸顺序。 由于M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）测序法采用的是DNA分子克隆的方法，即将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到一种合适的载体分子上。使用这样的克隆程序的本身，就可以保证所有来自同一个重组体克隆的后代，都含有一种同源的插入序列。另一个突出优点是，序列测定反应中所必须的引物序列是M13mp载体上多克隆位点两侧的已知序列（正向引物和负向引物），所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物，此引物称做“通用引物”（universal primer），这样就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。 DNA碱基序列测定的方法还有很多，近年来还应用荧光标记代替了同位素标记，它是用4种不同最大吸收峰的荧光物质标记4种不同碱基，这样就可用仪器代替人工读图谱，再经过计算机处理，序列测定可完全自动化，效率大为提高，这样连成一体的仪器称为全自动测序仪。 二、实验材料 外源DNA和M13噬菌体载体。 三、溶液与缓冲液 M13mp系列载体 E.coli JML01及感受态细胞 TE缓冲液 T4 DNA连接酶及缓冲液 DATP SOB培养基：100 mL中含2.0 g Tryptone，0.5 g Yeast extract，0.05 g NaCl，1.5％琼脂，混匀后加入KCl 0.186 g（pH 7.0）。 100 mmol/L IPTG：24 mg IPTG溶于l mL ddH2O。 2％ X-gal（M/V）：溶于二甲基甲酰胺。 2×YT培养基：100 mL中含1.6 g 胰蛋白胨，1.0 g 酵母粉，0.5 g NaCl，1.5％琼脂 （pH 7.0）。 0.7％YT上层琼脂：YT液体培养基中入0.7％琼脂。 LB培养基：100 mL中含1.0 g胰蛋白胨，0.5 g酵母粉，1.0 g NaCl，1.5％琼脂（pH 7.0）。 PEG 3 mol/L NaAc M13引物：互补于M13克隆位点3’端DN