分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(9).pptVIP

Western Blot实验注意的问题 （4）显色或显影： 显色： 辣根过氧化物酶：底物为DAB。 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT。 化学发光显影： 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次， 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定。 Western Blot实验注意的问题 （5）膜的再利用： 化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ），用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。 碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交。 Western blot操作视频 ELISA 原理： ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。 ELISA 常用的酶和底物 辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔黄色 ，检测波长492 nm； 底物为TMB， 蓝绿色， 检测波长450 nm。 碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯）,黄色， 检测波长405 nm。 ELISA各步骤的反应时间： 包被：24－36h，蛋白浓度为1－5 ug/ml。 封闭：37oC 2h 或4oC过夜（3％BSA）。 样本反应时间：37oC 45 min-1 h。 酶标抗体反应时间： 37oC 45 min-1 h。 显色时间：15 min(避光）。 实验要设对照。 可以一次包被多块板，冻存备用。 ELISA的类型 1. 间接法测抗体： 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗 抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性 抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。 方法： 抗原包被 封闭 待检抗体 洗涤 酶标二抗 洗涤 显色反应 终止反应 ELISA Reader检测 OD值。 ELISA的类型 2. 双抗体夹心法测抗原： 是检测抗原最常用的方法。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。 常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体 单克隆抗体＋单克隆抗体 后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。 用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用 于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形 成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。 ELISA的类型 3. 竞争法测抗原： (1)抗体固相测抗原：小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。 方法：抗体包被 封闭 同时加入待测抗原和酶标抗原 洗涤 酶底物 显色 ELISA reader检 测。 ELISA的类型 3. 竞争法测抗原： （2）抗原固相测抗原： 其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的标记过的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。 方法: a: 抗原包被96孔板； b:封闭; c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入96孔板； e: 洗涤； f：加入酶标二抗； g：洗涤； h：显色和检测。 如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测。 ELISA的类型 4. IgM抗体的检测: (1)间接法： 间接法ELISA一般仅适用