茶叶N甲基转移酶、SAM合成酶基因克隆的研讨.pdfVIP

摘 要 本研究以南昆山毛叶茶、英红9号、福云6号三个茶树品种为实验材 料，以茶叶咖啡碱合成代谢途径中的两个酶一一-N一甲基转移酶(NMT)和S- 腺普甲硫氨酸 (SAM)合成酶为对象，进行基因克隆的研究。N一甲基转移 酶依赖 SAM 为甲基供体，催化嚓吟甲基化，是咖啡碱代谢合成中的关键 酶。SAM是咖啡碱合成中的重要甲基供体，是由SAM合成酶催化L一甲硫 氨酸和ATP生成。随着分子生物学的发展，克隆茶树中N一甲基转移酶、 SAM合成酶基因，研究其在茶树咖啡碱代谢中的表达规律，对于通过遗传 工程途径从分子水平上改造茶树品种，培育低咖啡碱茶树品种具有重要经 济价值和实践意义。本研究主要得到以下结果: (1)英红9号N一甲基转移酶基因片段的获得。以英红9号基因组DNA 为模板，进行PCR扩增，扩增后得到一个长为673bp的片段，编码65个 氨基酸，其核昔酸序列与已在Genbank上登录的茶叶TCS1比对，同源性 为96 ，两者氨基酸序列的同源性为90%。分别以英红9号两个单株的 mRNA为模板，利用RT-PCR技术对N一甲基转移酶基因进行扩增，扩增后 分别得到长度为627bp与626bp的两个片段，各编码204与203个氨基酸， 两个基因片段的核昔酸序列与茶叶TCS1基因进行比对，同源性均为99%, 确认为茶叶N一甲基转移酶基因。 (2)福云6号N一甲基转移酶基因片段的获得。分别以福云6号三个 单株的mRNA为模板，利用RTPCR扩增技术对N一甲基转移酶基因进行 PCR扩增，扩增分别获得长度为432bp.637bp与627bp的三个片段，各 自编码 140个、140与205个氨基酸，三个基因片段分别与茶叶TCS1基因 核昔酸序列进行比对，同源性分别为100%,%%、99%，确认为茶叶N- 甲基转移酶基因。 (3)N一甲基转移酶基因保守结构域的分析。本实验获得的5个N一甲 基转移酶基因片段中，福云6号二号单株、福云6号三号单株、英红9号 二号单株、英红9号三号单株都包含了四个保守序列、三个SAM结合区A, B,C及一个保守域VFFF，与咖啡中N一甲基转移酶的核普酸与氨基酸序 列进行比较分析说明，N一甲基转移酶基因在遗传上具有高度保守性。 (4)南昆山毛叶茶SAM合成酶基因片段的获得。以南昆山毛叶茶的 基因组DNA为模板进行扩增，得到一个大小为602bp的片段，编码169 个氨基酸。将南昆山毛叶茶的SAM 合成酶基因与广东水仙茶树品种、番 茄、长春花进行比对，核昔酸序列的同源性分别为99%,84%,84%,氨 基酸序列的同源性分别为91%,88%,89%，表明从南昆山毛叶茶基因组 DNA中克隆获得的基因片段为茶叶SAM合成酶基因，且SAM合成酶基 因具有较高的遗传保守性。 (5)英红9号SAM合成酶基因片段的获得。以英红9号基因组DNA 为模板进行扩增，得到一个大小为602bp的片段，编码169个氨基酸。将 英红9号SAM合成酶基因的核昔酸序列与广东水仙茶树品种、番木瓜、 番茄、长春花进行序列比对后，同源性分别为99%,85%,85%,84%, 氨基酸序列与广东水仙茶树品种、中华称猴桃、番茄、长春花比对后，同 源性分别为91%,89%,88%,89%，表明从英红9号基因组DNA中克 隆获得的基因片段为茶叶SAM合成酶基因，且SAM合成酶基因具有较高 的遗传保守性。 关键词:茶叶;基因克隆;N一甲基转移酶;SAM合成酶 英文缩略语及中文对照 Amp Ampicillin 氨节青霉素 饰 Basepair 碱基对 cDNA complementaryDNA 互补DNA ddH20 Doubledistilledwater 双蒸水 DEPC Dieyhylpyrocarbonate 二乙基焦碳酸盐 dNTPs Deoxyribonucleosidetriphosphate 脱氧核糖核昔二磷酸(4种) dsRNA doublestrandRNA