实验三 微生物的分离和纯化(张理珉)PPT.pptVIP

一、培养基融化，倒平板和制备斜面 1、牛肉膏蛋白胨培养基： 冷却至60℃左右，倒平板。 2、马丁氏培养基： 冷却至60℃左右，加入链霉素至终浓度30μg/ml，混匀后倒平板。 3、高氏1号培养基： 冷却至60℃左右，加入3%K2Cr2O7 0.7ml / 500ml，混匀后倒平板。 每组倒13~17个平板（根据各班次组数具体安排）； 装若干支斜面试管（灭菌后摆放斜面），每种培养基统一制作（牛肉膏100支、马丁氏45支、高氏1号45支）。 和其它组交换8个平板（自已组没有的2种培养基平板，各4个），用于稀释涂布平板法操作（共计12个）； 平板划线分离法操作用牛肉膏蛋白胨培养基平板进行（2个，练习用）； 斜面下次实验使用。 二、平板的制备（操作要快）——演示 1、使灭菌的固体培养基冷却至60℃左右（容器外表面热而不烫），防止倒平板时过多冷凝水的产生； 2、准备好若干灭好菌的培养皿，拆去包装，堆放整齐备用； 3、一只手拿好装有培养基的三角瓶，除去瓶口的包装放好（内部不能向上），瓶口倾斜放于酒精灯外焰外部（不可直接烧烤）。 4、另一只手取1个灭菌的培养皿，抬平，放于酒精灯外焰外部（不可直接烧烤），打开培养皿盖（不可全开） ； 5、将培养基倒入已打开的培养皿内，使之刚好流平（15~20ml），放置于水平的桌面上待凝固后即可（凝固过程请勿再动培养皿，否则会造成平板培养基表面不水平）。 将上述平板放入28℃恒温培养箱中倒置空白培养24小时以上，以检查灭菌是否彻底。 同时还可以去除培养基表面多余的冷凝水水膜（24小时左右）。 三、平板及斜面无菌检查 以下为本次实验要完成的任务 四、制备平板的数量 ——根据实验组确定 牛肉膏蛋白胨培养基平板 ——（6个×实验组÷准备组+2个）=X个/组； 高氏1号培养基平板 ——（4个×实验组÷准备组+2个）=Y个/组； 马丁氏培养基平板 ——（4个×实验组÷准备组+2个）=Z个/组。 五、平板上的标注要求（一般要求在培养皿底部标注） 培养基名称 组别 稀释度 培养菌种名称 其它 注意 所有标注都可以用缩写或简写，目的只有一个，自已可以分清即可； 标注的内容是根据自己的实验所决定的，没有完全的模式。 六、斜面的制备 将固体培养基中加入的琼脂通过加热（90℃以上）完全溶解； 利用分装器将溶化的固体培养基加入到15×150mm试管中（最常用，也可根据实际情况选用其它规格），加入量为试管高度的1/4~1/5； 加塞、包扎、标记、灭菌； 摆放、冷却、无菌检查； 流程图： 称量→融化→调pH 值→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→搁置斜面→无菌检查→使用或备用 七、斜面制备的数量 1、牛肉膏蛋白胨培养基斜面 ——100支/全班； 2、高氏1号培养基斜面 ——45支/全班； 3、马丁氏培养基斜面 ——45支/全班。 实 验 内 容 三微生物的分离和纯化 一、基本概念 菌落——单个细胞（孢子）或少数几个同种细胞（孢子）在固体培养基上，经过适当培养后，形成肉眼可见的具有一定形态特征的细胞群体。 菌苔——若干菌落（同种或不同种）聚集在一起，不可分，无一定形状形态特征。 稀释倍数——溶液经过定量稀释后可以计算的倍数，一般用于CFU/ml计算。 稀释度——稀释倍数的倒数，标记和表述时用。 分离——指为了生产和科学研究的需要从自然混杂状态得到纯种的过程（可能达不到细胞纯）； 纯化——同一个菌落不一定是同种菌，需要对其进行纯化，使之达到细胞纯； 多数情况下，二者无明显划分，是统一在一起的过程。 发明培养基，并用其纯化微生物等一系列研究方法的创立； 证实炭疽病因 — 炭疽杆菌； 发现结核病原菌—结核杆菌； 科赫法则（4点） 罗伯特·科赫 （Robert Koch， 1843-1910） 二、实验原理 分离的目的： 得到单细胞 得到单细胞的手段： ①利用显微单细胞挑取器操作（仪器特殊，针对微生物效率不高）； ②稀释取样——单位体积由多至少→单位面积由多至少（单菌落分散好）。 操作流程图： 稀释→单细胞→培养形成菌落→挑取单菌落→多次重复达到纯化的目的 单细胞挑取法 简易单细胞挑取法 micromani pulator 三、实验方法和步骤 1、稀释涂布平板法 2、稀释混合平板法 3、平板划线分离法 1、稀释涂布平板法 倒平板→倒置空白培养24小时（?） →制备土壤稀