流式细胞术2.ppt

第二章 流式细胞术的应用;第一节 流式细胞周期与DNA倍体分析 1．细胞周期和倍体的概念 (1) 细胞周期: 从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累，到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期;G1期(DNA合成前期): 如果诱导细胞分裂，细胞首先进入G1期，在这一期间，细胞内RNA含量增加，合成细胞所需的蛋白质, 此时细胞不合成DNA。 S期(DNA合成期):一旦细胞开始合成新的DNA，细胞则进入了S期。 G2期(分裂前期):DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间，即细胞DNA倍增结束，细胞开始进入G2期，又称为DNA合成后期。 M期(分裂期): 随后细胞进入分裂期，即M期。时间区间指从有丝分裂开始到结束。 G0期(静止期): 有些细胞会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一些功能，称为G0期细胞。;(2)倍体： 正常静止期体细胞中染色体含量为二倍体数目。 含有异常数量染色体的细胞我们称之为异倍体细胞，这反映出DNA含量的变化。; (3) 流式细胞术测量DNA含量的变化与倍体关系 1)G0期（静止期）细胞: DNA含量为恒定的2倍（2C）; 2)G1期细胞: DNA合成前期，细胞为进入S期做物质准备，合成大量的蛋白质和RNA。DNA含量与G0期相同，(2C); 3) S期细胞: DNA合成期，当细胞进入S期后DNA含量逐渐增加，从2C～4C; 4) G2期与M期细胞: DNA合成后期和分裂期。 S期后细胞DNA含量倍增，细胞进入G2期，尔后最终进入M期；在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C。;;当进行DNA染色时，荧光染料（如PI）与细胞DNA分子特异性结合，而且有一定的量效关系： 1）DNA含量的多少与荧光染料结合成正比； 2）荧光强度与荧光染料分子多少成正比； 3）荧光强度与直方图中的通道数值(C)成正比。因此，在用FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期时，荧光的道数直接与DNA含量有关。;参比细胞为单倍体细胞, DNA含量为200道。 被测细胞G0/G1期峰在400道, 为二倍体细胞。;CV值（变异系数）：实测DNA含量直方图的G0/G1期峰为正态分布，测定过程存在一定的漂移，为精确解释这种漂移现象，在FCM分析DNA含量中引入了变异系数（CV值）。 实测结果的CV值包括仪器的CV值和实验样品的CV值。在实验过程中，一个生物细胞的CV值在5％以下的精度就足够了。;3． DNA含量与细胞周期分析的意义 DNA含量在细胞内所有参数中比较恒定，在细胞周期DNA含量随各时相发生周期性变化。 如果DNA含量发生微小的异常变化，则有可能导致恶性肿瘤细胞的产生。细胞癌变过程中伴随细胞DNA含量的改变，DNA非整倍体细胞是恶性肿瘤的特异性标志。 根据DNA分布直方图，可对细胞周期的分布状态进行分析，可计算出G0/G1 ％；S %；及G2/M ％。了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖生长的指标。 ;100％均为二倍体细胞（DIPLOID)。其中G0/G1占99%,无G2/M期细胞, S期细胞0.01%, G0/G1细胞峰CV值为2.94％。;100％为二倍体细胞：其中G0/G1占85.79%，G2/M期细胞2.68%，S期细胞11.53%， G0/G1细胞峰CV值为3.39％。;二倍体细胞占58.86%；G0/G1细胞峰CV值为3.39％。可见一个异倍体细胞峰为亚二倍体，占41.14％。DNA指数为0.81%。;多发性骨髓瘤骨髓细胞DNA分析;第二节: 流式细胞术在细胞凋亡检测方面的应用;一、概述： 细胞凋亡（apoptosis）又称细胞的程序性死亡 (programmed cell death)，是细胞在一定生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，它是一个主动的、高度有序的、基因控制的一系列酶参与的过程。细胞凋亡在形态上和生化上有其明显的特征。;;凋亡诱因连续作用进程中，DNA直方图的连续变化;细胞凋亡的分析;细胞凋亡——Caspases-3;细胞凋亡——Annexin Ⅴ;ANNEXIN-V/PI检测;流式细胞仪检测细胞凋亡——Annex in V/PI双染色法; Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白， 最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白， Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对 PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的 探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜 外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种 细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是 完好的，而细胞坏死在其早期