杨爱平FACSCanto流式细胞仪原理.ppt

FACSCantoⅡ流式细胞仪原理及应用 杨爱平 主要内容 什么是流式细胞仪？ 流式细胞仪可告诉我们—细胞相关知识 流式细胞术的应用 流式细胞术临床检测：TBNK、HLA-B27 流式荧光补偿知识（略） 什么是流式细胞仪？ 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器； 流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 FACSCanto II流式细胞仪系统组成 流式细胞仪 液流车（鞘液、shut down液、 cleaning液、工作液） 工作站（结果分析、处理系统） FACSCantoⅡ简介 配置空冷激光 两根激光:488nm、633nm、 光路固定，无需调校 液流系统 信号检测系统 八角形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号 电子系统将电信号转换成数字化信号 磁珠分选 常用荧光染料的特性 荧光信号的特征 常见荧光染料的发射波长 常用荧光染料(488nm,633nm激发) Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素 Phycoerythrin (PE) 藻红素 Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白 Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白 Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures) FACSCantoⅡ信号检测组件 光学滤片用于调整光谱的分布。 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。 长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过，并反射短于设定波长的光 带通滤片：允许一定带宽波长的光通过。 短通滤片（SP):短于设定波长的光通过，并反射长于设定波长的光 流式细胞仪如何检测细胞指标? 细胞的相对大小及表面积（前向角散射光信号，FSC） 细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC） 相关的荧光强度 散射光信号的特征 红细胞裂解的全血 液流系统-样本流速 样本流速的选择 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。 流式细胞仪可以告诉我们什么？ 细胞内和细胞外发生了什么事件？ 流式细胞术的应用 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒 细胞表面积 核浆比例 DNA含量和周期 RNA含量 蛋白质含量 …… 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内/外因子 激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸、PH、钙离子浓度 …… 细胞生理学研究 细胞相对大小和颗粒性分析 细胞周期分析 DNA含量分析-PI染色 细胞周期分析 DNA含量分析 细胞凋亡 细胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合 淋巴细胞亚群分析 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 B淋巴细胞（CD19+）与体液免疫有关 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。 * Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 聚焦的激光光束 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 *FITC 488 525 免疫荧光 绿色(CD3) *PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 (CD4) *PerCP 488 670 免疫荧光 深红(CD16+56) APC 633 670 免疫荧光 红色 PI 488 620 DNA染色 橙红 ECD 488