多重聚合酶链式反应检测Y染色体的AZF缺失.docVIP

精品论文 参考文献 多重聚合酶链式反应检测Y染色体的AZF缺失 田平（黑龙江省森工总医院 150040） 【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）39-0247-02 【关键词】多重聚合酶链式反应 Y染色体 AZF缺失 在男女不孕不育症中，男性血不育的因素约占40％，有文献报道：90％的男性不育症是由于生精功能障碍引起的，其中特发性生精障碍占60％，半数以上属原因不明者。而Y染色体正常与否起着至关重要的作用，因此研究Y染色体的相关基因有重要的临床价值。 在少精症和无精症的男性患者中，Y染色体向失占20.5％，据对Y染色体遗传序列的研究证实，Y染色体上向缺失是引起男子不育的主要原因之一。 Tiepolo和Zuffardi等于1979年发现在Yq11在存在着“无精子因子”(AZF)。它决定男性的精子生成。经实验证实，约13％的非梗阴性的少精或无精症患者是由于Y染色体长臂上的 AZF缺失造成，而随机选择的有生育能力的男子无此缺失。这些缺失位于AZFa，AZFb，AZFc区域(如图1所示)，这些区域中含有很多基因，我们设计了一个实验，通过对每个区域接近中心的位点进行一次PCR扩增来研究三个AZF区的缺失情况。在AZFa区域，我们检测SY87基因；在AZFb区域，我们检测 SY143基因；在AZFc区域，我们检测精子缺乏基因(DAZ)的外显子2。所有检测可以在同一管内完成，同时选用染色体上的基因RhE作为对照。 1　材料和方法 1.1 研究对象 15例经查无精中少精的男情不育患者(患者的确诊符合国际标准：无精症为精液中无精子；少精症为精子总数lt;4000万或lt;2000万／ml)的外周血样本，患者均为2007年6月至2009年6月因不育来本院男科就诊的患者，年龄在26～36岁之间。正常人对照2名，男、女各一例，均有正常孕产史，年龄在26～36岁之间。 采用PUREGENE试剂盒提取0.5ml外周血细胞DNA。 1.2 多重聚合酶链反应(PCR) 选用染色体上男、女共有的基因RhE作为对照。引物序列由美国遗传与不育诊疗中心提供，上海生工生物工程公司合成。在24mu;l反应体系中含AZFa、AZFb、AZFc、AZFE引物，dNTP，PCR缓冲液，Taq酶，双蒸水及1mu;1SU SG。PCR扩增程序为：94℃预变性8分钟；然后50℃1分钟，72℃1分钟，共循环32；之后15℃10分钟。放室温至电泳。 1.3 电泳 配制12％聚丙烯酰氨凝胶。每管反应物中加入2mu;l溴酚蓝，充分混合。每管取10mu;l加于胶孔中，同时加100bp分子量标准，400V电泳30分钟。在0.5mg/L EB溶液中染胶5分钟。在透射式紫外灯下观察结果(如图2)正常男性对照有SY87、SY143、DAZ、RhE四条带，正常女性对照只有RhE一条带，空白对照没有带。 2　实验与结果 2.1 15例患者的外周血标本经外同血细胞G显带染色体分析均未见异常。 2.2 12％聚丙烯酰氨背后胶垂直电泳 正常男性对照有SY87、SY143、DAZ、RhE四条带，正常女性对照只有DAZ一条带，空白对照没有逞。经实验测定，在15例患者中，有2例患者DAZ带缺失，有1例患者缺失SY87、SY143、DAZ三条带。结果如图2，3所示。 3　讨论 根据文献报道，Y染色体的微缺失发病率为1％～55.5％，其中非梗阻性的无精症患者平均为12％，严重少精症患者为6％。这个数学变化这么大，原因之一是各个实验室对患者的筛选标准不一致。另一个可能的原因是各个实验室所选择的目标序列(STS)及其数目不同。有的研究人员只选用一个位点，有的研究人员选用多个位点进行筛先。根据相关资料，本研究选择三个AZF区域的接近中心的位点进行实验，既可以筛选出造成生精障碍的患者，又避免了不必要的浪费。 Y染色体由于含重复序列的长区域，所以容易缺失。目前关于Yq的缺失可以引起精子生成异常有两种假设。一种假设认为，精子生成障碍完全由AZF区域所单独决定，每个患者症状的轻重由AZF区域所缺失的某一个或某几个基因而决定。在这一假设中，AZF区必须由至少两个精子生成基因构成。根据这种假设精子生成能力的下降的严重程度与Y染色体的缺失程度成正经。另一种假设认为，在环境、随机因素或AZF区域之外的其他基因的共同作用下，使AZF的缺失具有临床意义。由于我们所做的病例不多，还