药物分析（湖南大学） 第04章 药物定量分析与分析方法验证.ppt

第四章 药物定量分析与分析方法验证 供测定用血样的采集：动物实验时，可从动脉或心脏取血；对与患者或志愿者，采取静脉血（或用毛细管采血）。 血浆的制备：将采取全血置于含有抗凝剂（如肝素、草酸盐、EDTA等）的试管中，混匀后，以2500～3000r/min离心5min使血浆与血细胞分离，上清液为血浆。 血清的制备：将采取全血在室温下放置0.5～1小时，待血液凝固后，用细玻棒剥离血饼，以2000～3000r/min离心5～10min，上清液为血清。 药物与纤维蛋白几乎不结合，血浆与血清中的药物浓度测定值通常是相同的。但血浆比血清分离快，且制取的量多，所以血浆较血清更常用。 血样采取后，应及时分离血浆或血清，并立即进行分析。如不能立即测定，应置于具塞硬质玻璃管或聚乙烯塑料离心管中密塞保存。 短期保存时，可置于冰箱冷藏（4?C）；长期保存需在-20?C或-80?C下冷冻贮藏。 唾液 由腮腺、额下腺、舌下腺和口腔粘膜内腺体分泌液混合组成的。口腔粘膜受化学刺激，各唾液腺的分泌会受到影响，造成唾液组成发生较大变化。 唾液的采集：在安静状态下进行，漱口后15分钟收集；采集后立即除去泡沫，并以3000r/min离心10分钟，取上清液分析。 若分泌量少，可转动舌尖促进唾液分泌，也可采用物理的（如嚼石蜡）或化学的（如酒石酸）方法刺激。但经刺激后唾液中的药物浓度会受影响。 唾液采集后，应在4?C以下保存。 尿液 其主要成分：水、含氮化合物（大部分为尿素）及盐类。 体内药物（原型或代谢物及其缀合物）的清除主要通过尿液排出。 尿液中药物浓度高，采集方便、且采集量大。但尿液浓度变化较大。尿液中药物浓度的改变不能直接反应血药中的浓度。 尿液测定主要用于药物剂量回收，尿清除率、生物利用度、以及药物代谢及其代谢途径、类型、速率等的研究。 采集的尿液是自然排尿。 测定尿中药物的总量时，应收集用药后的一定时间内（如8h、12h或24h）排泄的全部尿液，记录体积后，量取一部分用于药物浓度的测定，在乘以尿量求得排泄总量。 肾功能不良者不宜采集尿样。 尿液采集后应立即测定，否则应加入防腐剂后置于冰箱中保存。 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、三氯甲烷，以及醋酸、盐酸等。 二、生物样品分析前处理技术 生物样品的前处理应主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和所采用的测定方法。 依据生物样品类型： 血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出。 唾液样品应采用离心去除粘蛋白。 尿液样品常采用酸或酶水解药物使从缀和物中释出。 依据被测药物的结构及性质，以及存在形式： 药物的酸碱性与溶解性涉及药物的萃取手段。 是否具有挥发性涉及能否采用气相色谱法测定。 光谱特性及官能团性质涉及是否需要制成衍生物。 浓度大的样品对前处理要求低，浓度越低的样品对前处理要求越高， 依据所采用的测定方法： 纯化程度与所采用的测定方法的专属性、检测系统对不纯样品污染的程度密切相关。 放射免疫测定法具有较高的灵敏度和专属性，生物样品只需经初步处理除去主要干扰物即可测定。 高效液相色谱法要求除去生物样品中的蛋白质，以防止蛋白质等物质在色谱柱上沉积。 蛋白质的去除 原因： 除去蛋白质可使蛋白质结合型的药物释放出来。 避免溶剂萃取过程中的乳化现象。 保护仪器性能（如保护HPLC柱不被玷污），延长使用寿命。 方法： 加入与水混融的有机溶剂 有机溶剂使蛋白质凝聚，释放与之结合的药物。 常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃。 含药物的血浆与有机溶剂的体积为1:(1～3)时，可除去90%以上的蛋白质。 加入中性盐 中性盐使溶液离子强度发生变化，将与蛋白质结合的水置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。 常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐 加入强酸 当溶液的pH低于蛋白质的等电点时，以阳离子形式存在的蛋白质可与酸根离子形成不溶性盐而沉淀析出。 含药物血清与强酸比例为1:0.6混合，可除去90%以上蛋白质。 常用强酸：10%三氯醋酸、65%高氯酸、5%偏磷酸。 过量的三氯醋酸经加热分解为三氯甲烷和二氧化碳而除去。 过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和后，加乙醇使之生成高氯酸钾（或钠）沉淀除去。偏磷酸可用同法去除。 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐而沉淀。 含药物血清与沉淀剂比例为1:2混合。 常用沉淀剂：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH。 酶解法 测定某些与蛋白质结合牢固、且对酸不稳定的药物时，需用酶解法使蛋白质分解而释放出药物。 常用酶：枯草菌溶素（适用pH：7.0～11.0，温度：50～60?C ）。 缀合物的水解 原因： 含羟基、羧基、氨基和巯基的药物可与内源性物质