影响Western_blot的因素.docVIP

Western blotting的影响因素 （一）：电泳 Western blotting是一个步骤繁多的实验。很多的操作过程，每一步都会对最后的结果产生影响，接下来的这几个帖子我想把我这段时间做Western blotting总结的一些影响实验结果的因素写下来，如果你有更好的建议，希望也能贡献出来，大家一起学习进步。 电泳过程是第一步，也是很重要的一步，好的电泳能让目的条带整齐，就像人工画的。要做好电泳也并非易事，我总结有这些方面的因素能影响电泳效果： 1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2. 凝胶质量。不连续SDS胶对凝胶的要求较高，具体的影响因素有：1.分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。2.所用丙烯酰胺的纯度和凝胶聚合时间，不纯的丙烯酰胺会含有丙烯酸，它会影响到凝胶内部局部PH环境，因此会影响电泳的效果，没有聚合充分的凝胶会含有游离的丙烯酰胺，也会影响到局部PH环境，它们还会与蛋白上的氨基、巯基以及酚羟基反应影响蛋白的泳动。凝胶聚合时间以分离胶45min，浓缩胶20min为宜。此外，单体放置时间过长也会造成丙烯酸的累积。3.凝胶母液混合是否均匀也会影响到凝胶浓度的分布。4.配备的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也会影响到网孔的大小，因此也会对电泳的质量有影响，一般取（30~40）：1，特殊要求的实验也可以灵活变动。5.APS及TEMED的加入量，APS极易潮解而失去活性，因此最好是现用现配，APS不宜加入过多，否则会氧化蛋白样品。TEMED作为加速剂，有利于氧自由基的富集，从而加速聚合反应，因此所用的TEMED尽量不要被氧化（氧化后发黄），还有加入的TEMED也不宜过多或过少，过多会升高PH值并能与蛋白反应，过少则会造成聚合不充分，网孔变大，并且造成游离丙烯酰胺单体的增多，它们也会和蛋白反应以及改变局部PH。6.点样孔底部要平整。 3. 点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。还有，加样之前最好先冲洗一下加样孔底部，减少没有聚合的丙烯酰胺的影响。还有，尽量从加样孔的中间点样，这样能使得样品在加样孔中的浓度分布尽量均匀，这也会对最终蛋白条带的形状有影响的。加样量也不能过高或过低，过高会影响条带的形状，过低不利于后面的杂交反应。 4. 电泳缓冲液。尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳定。 5. 电压条件。电压过高，一方面会使凝胶温度上升，改变凝胶内部PH值，甚至会造成溶胶，另一方面，电流过大也不利于蛋白分子的分离，容易造成条带变形，电压过低，又会有样品扩散的影响。我们经常用的浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平。 6. 其他的因素，如做胶的玻璃板要干净，底下或上面不能有杂质（如铁锈等），加分离胶之前要把上面的有机相洗干净，并尽量吸干水分。胶板加到电泳槽之后检查胶板底部是否有气泡，有的话用枪吹走，这个会严重影响电流方向，进而影响电泳效果。 （二）转膜 NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 较高 低 结合能力 80－110 ug/cm2 400 ug/cm2 125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合） 材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 ?缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿 检测方式 常规染色，可用放射性和非放射性检测 不能用阴离子染料 常规染色， 比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。 适用范围 0.45um 一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中) 糖蛋白检测和蛋白质测序 价格 价格较便宜 便宜 较贵 其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高，但效率也高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。 最后是实验操作方面的问题。使用PVDF膜的时候需要进行预处理，这里面