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电子显微镜技术 方 周 溪 潘亮亮 胡万里 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 电子显微镜室 温州医学院生物学实验教学中心 前 言 自从光学显微镜出现以后，人类打开了微观世界的大门，看到了很多用肉眼所看不到的微小物体，例如细胞、细菌等。但是，光学显微镜由于光线波长的限制，它的分辨极限是，有效放大倍数最高不超过2000倍，如果想要看到更小的物体，它就无能为力了。1924年，法国物理学家Broglie提出了“电子与光一样，具有波动性“的假说，他证明了任何一种粒子在快速运动时，必定都伴有电磁辐射，辐射的电磁波长与粒子的运动速度成反比，并计算出电磁波长为0.005nm。 1926年，德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或磁场中偏转聚焦的现象，类似于光线通过透镜可被聚焦一样。由此奠定了电子显微镜的理论基础。 1928—1931年间，德国年轻的大学生Ruska测量了磁透镜的聚焦特性，并开展了电子放大成像的研究，终于在1938年成功研制了世界上第一台真正的电子显微镜，放大倍数为1200倍，被誉为电子显微镜之父,并在1986年获得诺贝尔奖。电子显微镜的发明被誉为20世纪最重要的发明之一。 1939年，德国Siemens公司生产了第一台作为商品用的透射电镜，分辨率为10nm左右。但其体积庞大，无法进一步推广。 20世纪50年代初到60年代末期，电镜发展很快，从性能到构造都得到很大的改进，特别是分辨本领得到大幅度提高，达到1nm左右，到80年代的分辨率已接近0.1nm，必威体育精装版研制的超高压透射电镜的分辨率可达0.005nm。 自从193年第一台电镜在德国问世以来，在短短的几十年时间里，电镜技术取得了飞跃的发展，在医学、生物学等许多领域中得到了广泛的应用。电镜的应用为阐明组织细胞的结构和功能起了巨大的作用，已成为医学科学研究和临床疾病诊断的重要工具。一、与透射电镜有关的几个基本概念 光的衍射现象：  由于光具有波动性，当光线通过小孔或小 孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是: 中央部分一个亮斑，在其周围有明暗交替的园 环，即埃里（Airy） 3、分辨率 分辨率又称分辨本领，它表示仪器的分辨能力足以清楚分开的两点或两个质点圆心间最小距离的本领。它与光的性质，即衍射、干涉及透镜像差有关。 可以这么说，显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮斑半径D（分辨能力）的大小而定： 光学显微镜的分辨力可以根据阿贝公式来计算，即 D = 瑞利准则图示 这里以油镜为例推算其分辨本领： 光的平均波长为λ= 500nm = 0.5μm油的介质折射率或系数 N = 1.5 物体与物镜所形成夹角的半数α90o 则中央亮斑的半径 D≈200nm = 0.2μm 一般人眼在明视距离250mm处能分辨0.2mm的两点，油镜最小能分辨0.2μm的两点，则油镜理论最大放大能力为：0.2mm/0.2μm = 103 4、电磁波长 真空中相对集中并高速运动着的电子流称为电子束。电子束具有粒子性和波动性，它能产生一定波长的电磁波，其所产生电磁波长由下列公式表示，即： λ= n m 其中λ为电磁波长，V为加速电压。 由此可见，电子束的波长完全取决于加速电压，加速电压越高，则得到的电子波长越短，得到的分辨本领也就越高。 假如一台电镜的V = 50kV 时，则λ≈ 0.005nm= 0.000005μm是光的λ=500nm的10万分之一，大大减少了衍射光斑D的值。又假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,那么其理论放大倍数为0.2mm/0.1nm = 2x106 ，而实际有效放大倍数为1.6x106。 我室的H-7500型透射电镜的点分辨率为0.24nm，则其理论放大倍数为 0.2mm/0.24nm = 0.83x106 ，而实际有效放大倍数只有 0.6x106。 电镜的分辨率除了受电子束加速电压高低的影响外，还受很多方面的影响，如电镜本身部件的加工精度（各种透镜尤其是物镜的质量精度）、电镜的工作状态（如加速电压、真空度、电镜的运行模式等）、电镜室内及周边情况（如湿度、温度、电镜台的抗震动能力、电磁干扰等）以及样品制作的质量问题（如标本的固定情况、切片厚度、染色反差情况）等。也就是说，一台分辨力为0.1nm的电镜并不能就看清楚0.1nm大小的结构，可能只看清楚0.2nm大小的结构。由此可见，电镜的理论放大倍数与实际有效放大倍数还是有一定的差距的。 5、电镜的像差和畸变 电镜和光镜一样，由于光源或透镜的缺陷，可以发生各种像差或畸变。 ①球差：电子束光源通过透镜受到偏转，通过样品，从物平面向下发射，形成物点孔径角。从物点发出的射线，到达下一级透镜又被聚集。如果透镜有缺陷或孔径角太大，则靠近光轴