补肾方药对H2O2诱导损伤的MES23.5细胞HO-1表达研究.docVIP

补肾方药对H2O2诱导损伤的MES23.5细胞HO-1表达研究 蔡晶 王华金 王婷婷 吴鸿耀 吴芳华 郑毅婷 苏幼燕 （福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州） 【摘 要】 补肾中药一贯被认为具有“益肾填精，补骨生髓，健脑益智”的作用，在临床上广泛应用于治疗帕金森病等神经系统疾病。研究表明：在环境和衰老的共同作用下，通过氧化应激、线粒体功能衰竭、细胞凋亡等机制导致黑质多巴胺能（，MES）神经细胞大量变性、丢失，以致PD发病[1]。其中，氧化应激机制被广泛接受：大量的氧自由基（ROS）造成氧化损伤[2]，与MES神经元凋亡密切相关。同时，研究表明，血红素氧化酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)在机体的氧化应激过程中发挥着重要的作用[3]。故将传统中医理论与现代分子生物学结合，通过体外实验研究具有保护细胞生理功能的补肾中药合理配伍成补肾方药对过氧化氢（H2O2）建立的MES23.5神经细胞氧化应激模型保护作用机理，为补肾方药防治帕金森病提供科学的实验依据。 【关键词】 帕金森病 氧化应激 补肾方药 多巴胺能神经细胞 HO-1表达 1 研究理由及研究意义 帕金森病（Parkinson‘s disease，PD）又称“震颤麻痹”，巴金森症或柏金逊症,是中老年人常见的神经系统性疾病，也是中老年人最常见的锥体外系统病。主要病变在黑质和纹状体通路，多巴胺生成减少[4-5]。帕金森的病理及神经生化的主要改变为黑质和纹状体多巴胺（DA）能神经元变性，细胞内嗜酸性路易（Lewy）小体形成，以及纹状体DA递质量减少。目前引起PD病理改变的确切病因尚不清楚，有遗传学说、病毒学说、变性疾患、老化和环境学说等。许多研究提示可能与线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性神经毒性、神经营养因子缺乏、细胞凋亡等因素有关[6]。该病属中医学颤症、震颤、振掉等范畴，中医对帕金森病的认识可追溯到《黄帝内经》。《素问·至真要大论》说：“诸暴强直、皆属于风”，“诸风掉眩，皆属于肝”，“诸痉项强，皆属于湿” [7]。 补肾中药一贯被认为具有“益肾填精，补骨生髓，健脑益智”的作用，在临床上广泛应用于治疗帕金森病、痴呆、中风后遗症等神经系统疾病。药理研究也证实，以补肾为主的方药可以调节下丘脑神经细胞，改善实验动物神经系统老化，减少血管性痴呆大鼠脑神经细胞凋亡。因此，我们认为补肾方药在多巴胺能神经细胞抗氧化方面可能发挥优势。 2 国内外研究现状分析 2.1 氧化应激与帕金森病的关系 传统的理论认为，神经细胞损害的分子机制包括：①钙超载，大量的钙离子内流；②兴奋性氨基酸的大量释放；③自由基对神经细胞的直接作用。各方面互相影响。神经细胞损伤后引起细胞的凋亡，凋亡的发生与氧化应激相关，细胞内过高的自由基通过细胞内的信号传导引发细胞凋亡，用自由基清除剂可取得一定的疗效。建立神经细胞损伤的体外模型，是根据上述的原理来进行的[8]。 2.1.1 神经细胞损伤凋亡模型的建立 氧化应激反应的增强是导致多巴胺能神经元凋亡的主要因素之一,大量的氧自由基（ROS）造成氧化损伤[9]。氧化活性物质损伤神经细胞与神经细胞凋亡的发生直接相关，因此，可用此类模型来观察和筛选保护神经细胞的药物。H2O2是自由基的一种成分，同时易放出氧离子形成其它的自由基，故用它建立体外靶细胞的损伤模型及观察药物对自由基的抑制作用。实验药物可用下列3种形式加入：①用实验药物处理过靶细胞后，再加入H2O2的培养液；②实验药物与含不同浓度的H2O2的培养液同时加入；③含不同浓度的H2O2的培养液处理后再加入实验药物。第①种方法主要是观察药物对自由基损伤的预防作用，后两种方法是观察实验药物对自由基损伤的修复及治疗作用[10]。 H2O2损伤神经细胞时浓度参数的决定，源于不同组织、不同代数的各种神经细胞对H2O2的敏感性不同，因此，实验造模时各神经细胞所采用的浓度不同，用MTT法来确定H2O2造模时浓度参数，用酶标仪测定OD490的值，观察细胞的活性，当OD490的值在空白组的50%以内时，为H2O2造模的浓度参数[11]。 张芳等[12]采用H2O2作为损伤因素，检测2,3-吲哚醌（ISA）对多巴胺能细胞的保护作用及其机制。结果表明ISA可减轻H2O2导致的MES23.5细胞损伤，其机制与降低[Ca2+]水平有关。 徐胜利等[13]研究氧化应激诱导多巴胺能神经MES23.5细胞a-突触核蛋白C-末端片段核转位，用200umol/L H2O2处理多巴胺能神经细胞作为氧化应激的细胞模型。采用免疫荧光、硫磺素S组织化学染色和免疫印迹技术检测细胞氧化应激反应中a-突触核蛋白的表达状态和亚细胞定位。结果发现氧化应激可诱导多巴胺能神经细胞a-突触核蛋白C-末端约