第二章 微生物的纯培养和显微技术 第一节 微生物的分离和纯培养.pptVIP

§1微生物的分离和纯培养 无菌技术 一、无菌技术 无菌技术(aseptic technique):在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术。它是微生物研究进行的关键。 1、微生物培养常用的器具及其灭菌 器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等 灭菌方法：高压蒸汽灭菌。有些玻璃器皿可以采用高温干热灭菌。试管和烧瓶等需采用适宜的棉花塞子塞紧。 2、接种 接种:将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种. （2）、接种操作 无菌接种:培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具在无菌条件下将含菌材料接种于培养基上，这个过程叫做无菌接种。 二、用固体培养基分离纯化培养 菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落(colony)。 菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便称为菌苔(lawn)。 三、用液体培养基分离纯化培养 一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，需要用液体培养基分离。 通常液体培养分离的方法是稀释法。接种物在液体培养基中顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。 四、单细胞（单孢子）分离 单细胞（单孢子）分离法： 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。 五、选择培养分离 选择培养分离技术原理： 没有一种培养基或一种培养条件能满足自然界中一切微生物生长的要求，在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其他的被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设定一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。 七、微生物的保藏技术 菌种保藏的原理： 根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等条件，使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态。 传代培养保藏 冷冻保藏 干燥保藏 纸片保藏 薄膜保藏 寄主保藏 国内外菌种保藏部分情况 我国于1979年7月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM).该委员会下设6个菌种保藏管理中心,其负责单位、代号及保藏菌种的性质如下: 作业 1、固体培养基分离纯培养物的方法有哪些？每种方法应如何操作？ ★2、选择培养分离的方法有哪些，各自的原理是什么？ 用无菌的接种环以无菌操作沾取少许待分离的培养物，在无菌的平板表面上进行划线。 划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有扇形划线、连续划线、方格划线、放射划线、四格划线等。 平板划线法（streak plate method） 当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。 第二次划线 扇形划线 连续划线 方格划线 培养厌氧微生物 1、培养基熔化，冷却并保持在50℃左右， 2、待分离的材料用培养基梯度稀释，迅速摇动均匀， 3、冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物， 4、培养，菌落形成在琼脂柱的中间。 稀释摇管法（dilution shake culture method) 进行单菌落的挑选和移植，需要先用一只灭菌针将液体石蜡－石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。 如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到的纯培养物的概率就会急剧下降。 因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。 较大的微生物：可使用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜下进行。 个体较小的微生物：需采用显微操作仪，在显微镜下进行。 Mixed culture Pure culture Each colony was examined microscopically 根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。 1、利用选择培养基进行直接分离 如：耐高温菌采用高温筛选； 蛋白酶产生菌加牛奶筛选； 抗抗生素可采用加抗生素筛选 待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制 富集培养:人为创造一些条件只让所需的微生物生长，