第二十一章 毛细管电泳法.pptVIP

第二十一章 毛细管电泳法 电泳（electrophoresis）是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离分析的方法，称之为电泳法。 电泳与液相色谱的异同： 同：均为液相分离分析方法。 可用相同的理论来描述（差速迁移），一些色谱名词概念，如：塔板理论、速率理论、保留值等仍可使用。 异：分离原理不同； 仪器构造有很大的差异。 1、毛细管电泳柱效更高，塔板数可达105~106/m，（又称高效毛细管电泳，HPCE）； 2、分离速度更快； 3、溶剂、试样消耗极少，（纳升级）； 4、仪器成本低，（不需要高压泵）； 5、选择性高。通过选择操作模式和缓冲溶液的成分以达到对性质不同的成分的有效分离。 6、应用广泛。特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等生命科学领域的测定，以后逐渐被广泛应用于生物，化学，医药，环保等领域。与HPLC互相补充，共同成为分析化学中重要的分离分析技术。 第四节 毛细管电泳仪 基本结构： 高压电源、进样、填灌/清洗、毛细管 温控、检测、记录/数据处理 毛细管电泳仪示意图 一、高压电源 包括：电源、电极、电极槽 0~±30kV,精度1% 电极，铂丝（0.5~1mm） 电极槽 高压危险！！ 保护！ 二、毛细管柱 1.材料 玻璃：早期使用，现已淘汰。 电渗太强，对紫外光有吸收，并且杂质较多。 机械强度低，易折断。 聚四氟乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯： 机械和化学性能稳定，对近紫外光和可见光透明， 电渗较低。 缺点：样品吸附较强，热传导差，管内径不易均匀。 石英： 金属杂质少。 能够透过短紫外光，拨去一小段（约1cm）聚酰亚胺层后，即可作为光学检测器窗口。 机械强度高，不易折断。 表面存在硅醇基，产生氢键吸附，并产生电渗流。 2.内径和长度 CE实现高电场的关键部件是小孔径毛细管柱。在相同的电压下，孔径越小，电流就越小，产生的焦耳热量就越少。另外，孔径越小，散热效果也越好，柱效提高。 那么，是否孔径越小越好呢？ 虽然已有用2μm的报道，但是孔径小，样品负载小，检测困难，也增加了进样、清洗等操作上的困难。 常用25 ~75μm，最常用的是50μm和~75μm。 柱的外径一般是大一些好，外径越大，散热面积大，散热速度快。 常用外径 300μm。 3.未涂渍柱首次使用前的预处理 1mol/L NaOH 水 运行缓冲液 5～15倍柱体积 5～15倍柱体积 3～5倍柱体积 依次冲洗 柱长选择： 虽然增加柱长可以增加理论塔板数（电场强度须保持恒定），但是柱长增加将会降低电场强度的稳定性，解决办法是增加操作电压。 操作电压 焦耳热 所以，70cm为阈值，常用30cm左右（区带电泳）。 但是: 三、进样 1. 电动进样 当把毛细管的进样端插入试样溶液中并加上电场E 时，组分会因电迁移或电渗作用而进入管内。 优点：对毛细管的填充介质没有特别限制； 可实现自动化进样。 缺点：对离子组分存在进样偏向。uap大者，进多；小者进少或不进。如此，降低了分析的准确性、可靠性和重现性。 * 发展历史： 电泳技术从发明到现在已有百年历史。 Tiselius（提塞留斯）等使用电泳法从牛血清中分离出血清蛋白、α-、β-和γ-球蛋白，获1948年诺贝尔化学奖。 80年代初，细径（75μm）毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术——毛细管电泳。 毛细管电泳：毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。 传统电泳：受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。 传统电泳与毛细管电泳的区别： HPLC示意图 CE示意图 第一节 毛细管电泳的特点和分类 一、毛细管电泳的特点 二、毛细管电泳的分类 按毛细管中填充物的性质分类： 自由溶液 毛细管内填充物为pH缓冲的电解质溶液。如：毛细管区