ELESA检测基础知识课件.pptVIP

* --标记免疫技术的分类 --ELESA的原理与类型 --ELESA试剂盒组份 --ELESA操作要点及注意事项 标记免疫技术的分类 标记免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。 根据用途分为免疫组化技术（用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位）和免疫测定（用于液体标本中抗原或抗体的测定） 。 根据标记物可分为：荧光抗体技术、放射免疫分析、酶免疫技术 、化学发光免疫技术 和金标免疫技术等 ELESA的原理与类型 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(ELISA）用于IgG定量测定的文章,使得用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。 酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相（homogenous）和异相（heterogenous）两种类型 。 如以标记抗体检测标本中的抗原为例，其反应式如下： Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab* 如在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。 如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物*失去其特性，例如酶失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行Ab*Ag与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相法。 ELISA的原理 ELISA的这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 抗原 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原（hapten）。例如某些激素、药物等。 抗体 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作载体的材料很多，主要有聚苯乙烯和聚氯乙烯两种，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，。最常用的是聚苯乙烯。 固相载体以形式分有：微孔板、磁性微珠和小试管。以微孔板最为常用。 酶与底物 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。 应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP) 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：　　　 HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O　　上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。 。 TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm EL