糖类色谱分析.docVIP

■目　录 １．前言 …１ ２．糖的种类和物理性质 …１ ２－１　单糖 …1 ２－２　二糖?低聚糖 …2 ３．在糖分析中使用的色谱柱 …３ ３－１　正相色谱柱 …3 ３－２　聚合体系强阴离子交换色谱柱 …4 ３－３　反相色谱柱 …5 ４．在糖分析中使用的检测器 …６ ４－１　差示折射率计（RI检测器） …6 ４－２　脉冲式电化学（PAD）检测器 …7 ４－３　萤光检测器 …8 【参考文献】 …8 ５．糖分析实例 …９ ５－１　利用RI检测器进行糖分析的案例 …9 ５－２　利用PAD进行糖分析的案例１ …15 ５－３　利用PAD进行糖分析的案例２ …19 ５－４　利用PAD进行糖分析的案例３ …23 ５－５　利用FL检测器进行糖分析的案例１ …25 ５－６　利用FL检测器进行糖分析的案例２ …28 ５－７　利用LC-MS进行分析的案例 …31 １．前言 糖是三大营养素之一，是人体的构成成分及能源。糖是由C、H、O三种元素构成，由于可用一般式Cm(H2O)n表示，所以也被称为碳水化合物(carbohydrate)。广义地说，如“氨糖”、“酸性糖”那样，有时将含氨基以及酸性基的物质也分为糖类。或者是根据分子大小不同，有时也可将糖分为单糖、二糖等在20碳单位以内的低聚糖和淀粉、糊精、纤维素等多糖。 在本手册中，将对单糖、二糖的分析系统以及分析手法作以介绍。在使用HPLC进行分析时，由于一般的中性糖在紫外不产生吸收，所以必须对中性糖的检测方法进行深入探讨。在这里，将对糖分析中使用的色谱柱、检测器的特点、实际的测定系统以及分析案例作以介绍。 ２．糖的种类和物理性质 ２－１　单糖 单糖类可能形成环状以及直锁状的构造。如果是直锁状的构造，其末端是醛的单糖类（醛糖※），在水溶液中二种环状构造通过直锁型构造而保持平衡状态。如果是环状构造，羰基的碳（C1）也形成不齐碳，该位置的氢氧基不同方向的二种异性体被称为各自正位异构体。而且将C1称为正位异构体碳，将与C1相结合的OH称为正位异构体氢氧基。 ※：形成直锁状而且具有酮基的糖被称为酮糖。 图1　水溶液中D-葡萄糖的构造 单糖类一般极易溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮等。另外，不溶于苯、酯、氯仿等。 ２－２　二糖?低聚糖 二糖就是两个单糖，低聚糖是比较多的单糖通过糖苷结合而形成的糖类。如蔗糖、乳糖那样，二糖类具有人的营养所需要的重要成分。一般的低聚糖，有作为游离型或者是配糖体（糖和另外的化学种类相结合的物质）而在生理学上具有意义的大小而合成的、或者是作为多糖类的加水分解物而生成的。 从不同结合方式看，由于单糖间的结合方式不同，有还原性二糖类（麦芽糖型）和非还原性二糖类（海藻糖型）两种。在还原二糖类中，由于单方的正位异构体氢氧基和另外的乙醇性氢氧基结合，具有游离的正位异构体氢氧基，所以具有还原性，存在α型和β型两种异性体。在还原型二糖类中，有麦芽糖、乳糖、纤维素二糖、龙胆二糖等。如果是非还原性二糖类，由于构成单糖的正位异构体氢氧基相结合，不显示还原性。在非还原性二糖类中，有蔗糖、海藻糖等。 低聚糖易溶于水或者水和甲醇或者水和乙腈的混合溶液，不溶于苯、酯、氯仿等。 ３．在糖分析中使用的色谱柱 作为糖分析中使用的色谱柱，大致有正相色谱柱、糖分析用色谱柱（强阴离子交换色谱柱）、可使用100％水的反相色谱柱等。 ３－１　正相色谱柱 在糖类分析中最常使用的色谱柱是NH2色谱柱。但是存在一个问题，就是在传统的NH2色谱柱中，氨丙基直接与硅胶结合，氨基的强碱性会使基质硅胶溶出，在含水率高的流动相中，色谱柱寿命比较短。 在CAPCELL PAK NH2 UG80中，硅胶表面被硅酮聚合体保护，而且，在NH2基导入前，设置具有架桥构造的聚胺层。因此，与传统的NH2色谱柱比较，具有极强的化学稳定性。在SG80类（分离特性相同）中，充填剂表面的聚合体更加严密，其耐久性更加优越。 CAPCELL PAK NH2 UG80的物性值如表１所示。 表１　CAPCELL PAK NH2 UG80的物性值 基材 高纯度硅胶 官能团 含聚胺的架桥构造的NH2(氨基) 细孔径 ( nm ) 8 比表面积(m2/g) 450 C% 14 密度(μmol/m2) 1.4 可使用的pH范围 2 – 8 流动相使用乙腈／水的混合液。通过变化乙腈／水的比率，调整保留时间，水的比率越高，溶出越快。在使用NH2色谱柱的场合，如用水作样品溶剂，与流动相比较，溶出力比较强，会出现保持时间短的峰比较宽的情况。样品溶剂至少应该选择50%以上的乙腈，最好尽量作成与流动相相近的组成。糖类一般易溶于水，不溶于乙腈，所以在溶解样品时，应该采取首先将糖类于溶解水，再加乙腈或者是用流动相稀释等方法。 ３－２　聚合体系强阴离子交换色谱柱 糖类的乙醇性氢氧基，