基因工程干扰素.ppt

Page ? * Page ? * 基因工程操作流程 利用ncbi查找目的基因序列 利用oligo设计引物 利用PCR技术扩增目的基因 选择载体，抽提质粒 制备感受态细胞 目的基因与载体重组 外源基因导入受体细胞 重组子筛选 外源基因的表达 利用NCBI查找目的基因 打开NCBI网站，我们查找了人类ɑ-干扰素的基因。 查找之后利用oligo软件设计引物 查找引物 查找酶切位点，点击search 编辑上下游引物 得到上游引物为： 5‘-GTCGGTACCGACGACGACAAGTGCGATCTGCCGCAGACCCATA-3’ 下游引物为：5-TAAGAATTCTTATTATTCTTTGCTTTTCAGGCGT-3’ 上游引物的酶切位点是Kpn1(GGATCC) 下游引物的酶切位点是EcoR1(GGTACC) 利用PCR技术体外扩增目的基因 以上两条引物与表达载体的部分序列重叠，并覆盖Kpn1和EcoR I两个酶切位点．用以上经纯化的连接产物作为模板，用上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下： 模板 2ul 上游引物V-100uM) 1ul 下游引物F-200uM 1ul 10XTaq DNA聚合酶缓冲液 5ul dNTP混合物f各2．5mM) 4ul MgCl2(25mlV0 3ul Taq酶 1ul dH20 33ul 总量 50ul PCR反应条件如下： 94℃ 3min 94℃ 20s 58℃ 25s 20循环 72℃ 25s 72℃ 5min 一般是94度变性5min，之后“94度变性、退火（不同引物温度不同）、72度”延伸共30-35个循环，再72度延伸10min，最后hold16度即可。反应体系一般有20微升或50微升，由上下游引物、buffer、dNTP、模板、Taq酶和水等组成，配好后放入PCR仪中按设定程序进行即可。 选择载体和抽提质粒 1、质粒DNA 的分离纯化 一般含有单个目的基因的DNA 片段，即使进入了宿主细胞也不能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的DNA 分子（例如质粒、噬菌体DNA 等）结合后，才能在通过转化或其他途径导入宿主细胞，像正常质粒或病毒一样增殖和易于检测。 分离质粒载体DNA 有许多方法，但其共同步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例如SDS），使其发生温和的溶菌作用。这样质粒DNA 、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA 等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染色体的DNA 则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理，可使其同质粒分开。将离心所得的含有质粒DNA 的上清液，加酚处理除去蛋白。剩下的DNA 混合物中，质粒DNA （cccDNA ）呈超螺旋状态。为进一步纯化出cccDNA 分子，可在含有溴化乙锭（EB）染料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。EB是一种扁平分子，它能插入双链DNA 分子的两个相邻碱基对之间，从而降低了DNA 分子在氯化铯中的密度。又由于cccDNA 同EB的结合能力比开环DNA 和线性DNA 低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA 同其他两种类型的DNA 分离开来其他载体DNA 分高纯化的原理与上述类似。 2、目的基因与载体的连接。 外源DNA 片段与载体DNA 分子的连接，即DNA 分子的体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA 连接酶的作用。在进行连接时，一般需要注意以下几点：① 实验步骤尽可能简单容易；② 在连接后，接点序列能被一定的限制酶重新酶切，以便回收插入片段；③ 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 我们选择载体pET32a(+）Map 感受态细胞的制备 首先配制以下试剂： 1)SOB培养基 配制500ml SOB培养基，在450ml水中加入以下试剂： 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract)． 2．5g NaCl 0．25g 用电磁搅拌器搅拌使其完全溶解，然后加入250mmo