基因工程原理beike.ppt

2. λ噬菌体载体的 构建 原理：删除多余限制位点e.g.5EcoRⅠ； 步骤： 类型：插入型：一个 替换型：成对 3.常用λ噬菌体载体 凯伦噬菌体载体：1977 F.R.Blattner等 4.应用 体外包装（5%-75%），23kb 4.3柯斯质粒载体 柯斯质粒： λ噬菌体cos位点+质粒复制子 特点：具有λ噬菌体特性； 质粒载体的特性； 高容量 应用： 4.4单链DNA噬菌体载体 M13噬菌体生物学特性 M13噬菌体载体 非必要区：IS 类型：插入一个lac操纵子片段； 在上一基础上再插入一多限制酶的人工接头 应用： 4.5真核细胞的克隆载体 植物基因克隆的载体：Ti质粒 Ti质粒的结构和特性 环状，双链DNA，1.5-2×105； T-DNA 动物基因克隆的载体： 技术：电穿孔，显微注射，原生质体融合，病毒载体 SV40病毒（猿猴空泡病毒40）， 5.2 kb SV40病毒 DNA，蛋白外壳 2. SV40病毒载体 取代型的重组病毒载体 重组的病毒-质粒载体  4.6噬菌粒载体（phagemid） 质粒+单链噬菌体载体；3000bp 第五章 基因分离与重组及重组体向宿主细胞的导入 基因克隆的基本步骤： 1.目的DNA片段的获得 2与适当的载体体外连接 3.重组体导入寄主细胞 4.选择与鉴定重组体的克隆 5.1目的基因的获得 化学法，基因文库钓取，mRNA逆转录 1.化学法合成 150-200bp，干扰素基因 2.构建基因文库钓取目的基因 （1）基因文库： 载体： λ噬菌体 25kb；质粒 15kb；柯斯质粒 45kb （2）适当的基因探针 3.逆转录法 特异高度分化组织；总RNA 3.2DNA连接酶（1967） 作用机理：封闭双螺旋DNA上缺口 类型：DNA连接酶, T4DNA连接酶 DNA片段的连接： 粘性末端 平末端（1） T4DNA连接酶 （2）同聚物加尾法：末端脱氧核苷酸转移酶 3`-OH （3）衔接物连接法：10-12，酶识别位点 （4）接头连接法：粘，平 3.3DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 1957，美，Kornberg 1.多功能 5`-3`聚合酶；5`-3`外切酶；3`-5`外切酶 2.DNA杂交探针的制备 缺口转移法 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（ Klenow 酶） 1.活性 5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶 2.用途 修补3`隐蔽末端； 标记DNA片段末端； CDNA克隆的第2链CDNA的合成； DNA测序 T4DNA聚合酶 5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶 逆转录酶 1.活性 RNA依赖的DNA聚合酶； DNA依赖的DNA聚合酶； 外切酶活性 3.4DNA和RNA的修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶； T4多核苷酸激酶； 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 T4多核苷酸激酶与DNA分子的5`末端的标记 碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 第四章 基因克隆载体 质粒载体，15kb 噬菌体载体，15kb Cosmid，31-45kb 单链DNA噬菌体M13，1kb 动物病毒 4.1质粒载体 天然质粒：F，R，Col 天然质粒特性 双链闭合环状DNA分子 复制类型 不亲和性 质粒载体的选择 质粒载体具备条件： 自主复制； 限制酶单一切割位点； 筛选标记； 小，多拷贝 大肠杆菌质粒载体： PSC101，9.09kb；（1973） ColE1，6.3kb； pBR322，4.3kb 4.2噬菌体载体 噬菌体一般特性 核酸，蛋白质外壳 温和，烈性 λ噬菌体载体(1974) 1.λ噬菌体 DNA分子，48502bp 基因工程原理 第一章基因与基因工程 1.1基因的现代概念 1903 Sutton,Boveri遗传的染色体学说 1909 Johannsen基因 1910 Morgan基因学说 1941 Beadle,Tatum一基因一酶 1944 Avery,遗传物质DNA 1953 Watson,Crick双螺旋 1973 基因工程诞生 （分子水平） 跳跃基因：1956McClingtock；断裂基因：外显子，内含