7-细胞培养.ppt

3-2 看护培养基本技术 （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm2）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。 （3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。 要求： （1）看护愈伤组织处于活跃生长状态； （2）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养下则分裂，为什么？ Nurse callus provides nutrition and other substances that enhances cell division. （营养物质和促进细胞分裂物质） 特点： 1）效果好，易于成功。 2）简便易行。 3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。 4、微室培养法 微室培养的含义及用途 含义：即将细胞培养在很少量的培养基中，置于微室中进行培养，使单细胞生长繁殖的培养方法。 用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。 微室培养特点： 在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。 微室培养要求： （1）微室内不能有气泡。 （2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖 玻片的厚度要在0.17-0.18毫米左右。 （3）观察时要保持温度和培养时的一致。 三、影响单细胞培养的因子 1、培养基成份 植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化学不明确物质；相互依赖 2、初始细胞植板密度(临界密度) 临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。 初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。 3、生长激素 加1种细胞分裂素和几种氨基酸。临界密度只需25-30细胞/毫升。 4、pH 5、CO2 第二节 细胞悬浮培养 一、培养类型：分批培养和连续培养 分批培养 分批培养是指细胞在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物，当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。 分批培养所用的容器一般是100～250ml三角瓶，每瓶装有20～75ml培养基。为了使分批培养的细胞不断增殖，必须进行继代，方法是取出培养瓶中的一小部分（通常为总体积遥1/5～1/3）悬浮液，转移到含有相同成分的新鲜培养基中。 在分批培养中，细胞数目增长的变化情况表现为S形曲线。开始为滞后期，细胞很少分裂；进入对数生长期后，细胞分裂活跃，数目迅速增加；经过3～4个细胞世代之后，培养基中某些营养物质已经耗尽，或是有毒代谢产物的积累，增长逐渐缓慢，进入静止期后，增长完全停止。 分批培养对于研究细胞的生长和代谢并不是一种理想的培养方式。 连续培养 连续培养是利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。连续培养过程中，不断注入新鲜培养基。排掉等体积的用过的培养基，培养液中的营养物质得到不断补充。由于注入的新鲜培养液的容积与流出的原有培养液相等，可调节流入与流出的速度，故培养的细胞生长速率相对一致，形成一个稳定状态的培养。连续培养对于植物细胞代谢调节的研究，决定各个生长限制因子对细胞生长的影响，以及次生物质的大量生产等都有一定意义，但它们需要的设备比较复杂，投入的精力较多，现在还未被广泛应用。 二、悬浮培养类型 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件： 一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小； 二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同； 三是生长迅速。 要建立良好悬浮细胞需注意以下事项 诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。一般条件下，以幼胚诱导的愈伤组织为最佳，因为它的质量好，分化能力强。某些情况下直接用幼胚、下胚轴、子叶等作外植体进行悬浮培养也比较容易建立悬浮细胞系。 一般颗粒细小、疏松易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织，比较疏松易碎，经过几次筛选、继代至稳定后，可以用于诱导悬浮细胞系。一般使用的激素是2mg·L-12,4－D，或附加少量0.5mg·L-1的BA和NAA，培养基常用N6、MS或B5。附加有机物对愈伤组织的状态极为重要，如水解酪蛋白、L－脯氨酸、谷氨酸胺对诱导疏松愈伤组织有利。除此以外，培养基中蔗糖浓度较低时（10～30g·L-1）也有利于疏松愈伤组织的形成，而浓度较高时则容易形成坚硬的