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实验七 酶促反应动力学实验 酶促反应动力学 概念： 酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素。 反应速度：单位时间内底物减少或产物增加的速度，常用初速度来衡量。 影响酶促反应速度的因素： 底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH 值 抑制剂 激活剂 中间产物学说 E+S ES E+P 米---曼氏方程（Michaelis-Menten equation） Km与 Vmax的意义 Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度； Km可用来表示酶对底物的亲和力大小， Km与酶对底物亲和力大小成反比； Km值是酶的特征性常数之一， Km值范围在10-6 ~ 10-2mol/L Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比； k3为酶的转换数：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变为产物的分子数。1~10 4/s Km值与 Vmax值测定 双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934） 1 = Km 1 + 1 V Vmax [S] Vmax 竞争性抑制的特点： I与S分子结构相似； Vmax 不变，表观Km增大； 抑制程度取决于I与E的亲和力 ，以及[I]和[S]的相对浓度比例。 非竞争性抑制的特点： 1、I与S分子结构不同； 2、Vmax 减小，表观Km不变； 3、抑制程度取决于[I]大小。 思考题： 1、概念：酶、酶活性、反应初速度、酶活性中心、必需基团、Km、最适温度、最适pH、竞争性抑制、 2、比较竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制作用特点及林-贝氏图；简述竞争性抑制的理论和实际意义。 酶的分类 1、氧化还原酶（oxidoreductase） 2、转移酶（transferase） 3、水解酶（hydrolase） 4、裂解酶（或裂合酶lyase） 5、异构酶（isomerase） 6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase） 拓展 1、可通过以后要学习的实验，开展酶的分离，纯化，理化特性分析研究。 2、纯化酶可进行结构、序列分析。 3、可通过修饰等方法掌握酶的活性中心。 4、可进行酶的细胞化学定位。 5、可进行同功酶分析，了解不同物种、品种、品系的遗传性差异。 1. 加入酶液立即计时，迅速混匀置37℃水浴15min。 注意：酶促反应开始，从加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应，各管反应时间应准确一致，均为15分钟。 2. 保温后各管立即加入0.5M NaOH溶液1.0ml，快速混匀，防止局部浓度过高。 3. 各管混匀之后再分别加入0.3%4-AA1.0ml及0.5%K3Fe（CN）62.0ml，混旋仪充分振荡混匀，使显色完全。室温放置10min后以6号管校正零点，在分光光度计中比色(λ=510nm) 注意：必须立即混匀，否则显色不完全。 注：表1～表3中，基质液即底物液（磷酸苯二钠） 表1 表2 以下操作同表1步聚中1、2、3、步 表3 以下操作同表1步聚中1、2、3、步 * 生物化学与分子生物学实验 特点：独立性，广泛应用性。 范畴： 几种常用生物大分子制备技术 光谱技术、层析技术、电泳技术、离心技术 放射性同位素技术 分子克隆、外源基因表达、分子杂交 要求： 实验报告书写 实验目的： 原理： 操作： 结果： 分析/讨论： 注意事项： Enzyme; Ribozyme Kinetics of enzyme-catalyzed reaction 产 物 0 时 间 初速度 酶促反应速度逐渐降低 酶促反应的时间进展曲线 k1 k2 k3 一、底物浓度对酶促反应速度的影响 v Vm 0.3 0.2 Vm 2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [S] [S]与v关系： 当[S]很低时，[S]?与v?成比例-- 一级反应 当[S]较高时，[S]?与v?不成比例 当[S]很高时，[S]?，v不变--零级反应 V= Vmax [S] Km + [S] 米-曼氏方程解释： 当[S]??Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于[S] 当[S]??Km时，v ?Vmax, 即[S]?而v不变