酶的分及离纯化.pptVIP

主要指透析；利用小分子扩散作用透过半透膜，而大分子被截留；用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。透析设备简单，但操作时间长，要更换水或缓冲液。 3、扩散膜（透析）膜分离 膜公司网站 Back 式中： S、So：蛋白质或酶在离子强度为I和0时的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，取决于盐的性质和酶的结构 I：离子强度,与离子浓度mi和离子价数Zi有关。 I=1/2∑miZi2 酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度的关系式： 蛋白质和酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度有密切的关系 β=LogSo ：取决于酶的性质，也与温度和pH有关。 Ks：主要取决于盐性质。与离子价数成正比，与离子半径与溶液介电常数成反比。 β与Ks确定后，蛋白酶溶解度决定于I Ks分段盐析: T、pH一定下改变离子强度 β分段盐析: 一定盐和离子强度下，改变T、pH 常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。 盐析所需添加饱和硫酸铵体积式： 温度和pH一定时，So为常数， 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%饱和度 饱和 析出 析出 分段盐析 常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析法。 透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。 透析袋 蛋白质溶液 蒸馏水 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质（如酶、蛋白质、氨基酸等）具有不同的等电点这一特性进行分离纯化的方法。 等电点时，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶液中除杂和与其它方法联系使用。 二、等电点沉淀法 图例 介电常数 溶质分子之间的引力 溶解度 有机溶剂 溶质分子周围的水膜破坏 酶和蛋白质的氢键破坏 空间结构变化 形成疏水层 三、有机溶剂的沉淀法 利用酶等物质在有机溶液中的溶解度不同而使之分离的方法。 介电常数permittivity 亦称相对电容率。是指在同一容器中用某一物质为电介质和真空时的电容的比值。介电常数通常随温度和介质中传播的电磁波的频率而变。电介质的介电常数越大，极化能力越强；介电常数越小，绝缘性能越好。用εr表示 （1）所析出酶沉淀比盐析法析出的易于 离心分离或过滤； （2）不含无机盐，适于食品工业用酶制 剂的制备； （3）易于除去或回收。 优点： 缺点： 易于引起酶的变性失活，需低温操作和沉淀析出后尽快分离。 酶+酶沉淀剂 复合物沉淀 分离 从复合物中析出酶 四、复合沉淀法 常用的酶沉淀剂： 单宁（加入量为酶液的0.1~1%。） 聚丙烯酸（30~40%）等高分子聚合物 五、选择性变性沉淀 使杂蛋白变性沉淀，而酶不受影响； 热稳定性好的，可进行热处理； 改变pH或加入某些金属离子使杂蛋白除去； back 第四节 离心分离 离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、密度的物质分离的技术； 要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等分离； 2、高速（冷冻）离心机 1×104-2.5×104rpm，相对离心力104~105g,用于沉淀、细胞器等分离； 3、超速离心机 转速2.5-8×104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质及细胞器病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。 分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超速离心机装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统； 一、离心机的种类与用途 台式高、超速离心机 0.6-10万转/分以上 离心机 制备性 分析性 分析性超速离心机 普通离心机 冰冻离心机 台式（或地面式）普通离心机 大容量冰冻离心机 小于0.6万转/分 高速冰冻离心机 0.6-2.5万 超速冰冻离心机 2.5-8万或更高 (