分子生物学改造.ppt

蛋白质分子的生物学改造 蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等； 天然生物材料中蛋白质含量较少； 基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）； 多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途; 利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。 在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。 通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。 蛋白质工程的主要技术之一是定点突变技术. 一、定点突变 利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点突变（site directed mutagenesis）。 定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。 二、基因定点突变的意义 用于研究基因的结构与功能； 通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。 如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变改变蛋白质生物学活性的成功例子。 加入二硫键增加蛋白质的稳定性 蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（－SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（－Ｓ－Ｓ－）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。 在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建了T4溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性. T4溶菌酶和6种设计的变体特性 酶 氨基酸的位置 二硫键的数目 相对活性 Tm 3 9 21 54 97 142 164 (%) (℃) wtα Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9 pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9 A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7 B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.9 wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六种设计的半胱氨酸变体；Tm:熔点温度 将Asn和Gln转换成其他氨基酸 当蛋白质暴露于高温时: 天冬酰胺（Asn） 天冬氨酸(Asp) + NH3 谷氨酰胺(Gln) 谷氨酸(Glu)