高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用.docVIP

高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用 植物丁颖班 何健伟 200930700207 摘 要 : 对近年来高效液相色谱法分离和测定蛋白质技术作一综述，比较详细地介绍了各种HPLC模式、检测器,以及联用技术的应用情况。对今后高效液相色谱法在蛋白质研究方面的作用作一展望。 关键词：高效液相色谱 检测模式 蛋白质 分离测定 联用技术 前言：蛋白质是生命有机体的主要成分,在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以蛋白质的分离和检测一直是人们研究的热点。然而蛋白质是一种长链高分子化合物,相对分子量 大,在溶液中的扩散系数小、黏度大、易变性,这增加了蛋白质分离、分析的困难。目前，高效液相色谱法广泛用于蛋白质的分离和检测。高效液相色谱(HPLC)具有分析速度快、分离效能高, 检测灵敏度高样品适用范围广等优点因此在药学研究和生物医学测定中都得到了广泛的应用。在高效液相色谱技术中,分配色谱、亲和色谱、离子交换色谱和凝胶排阻色谱都能够用于蛋白质的分离与鉴定。本文对这几种色谱作一简要介绍。 1 HPLC基本原理 HPLC由液体输送系统、进样系统、色谱柱和检 测系统 4部分所组成。输液泵将流动相 以稳定的流速 (或压力)输送至分析体系 ,在进 入色谱柱之前通过 进样器将样品导人 ,流动相将样 品带人色谱柱 ,在色 谱柱 中各组分依照分配系数 、吸附力大小 、带 电性 质 ,乃至分子量大小的差异而被分离 ,并依次随流动相流至检测器 ,将检测到的信号送至数据系统记录 、 处理或保存。随着HPLC技术的日趋成熟,它已成为 分离和检测蛋白质的重要工具 。 2 蛋白质的HPLC分离模式 物理、化学功能等特征差异是蛋白质分离、检测的基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性功能等特性以及蛋白质的来源、实验要求等可以选择不同的模式来分离目标蛋白质 2.1 反 相 高 效 液 相 色 谱 (RP-一HPLC) RP_HPLC在HPLC各种模式中的应用最为广泛,但目前比较流行的色谱柱在蛋白质的检测方面并不多见 。这是因为蛋白质的混合物要在 RP— HPLC中得到分离, 必须有极性的差异, 且在固定相和流动相中都有分配 ,而蛋白质通常都是强极性的化合物,与柱的结合较闲难。另外,RP_HPLc 常用的流动相,如甲醇、乙腈等都能使蛋白质变性沉积而导致色谱柱报废。因此, 当RP_ HPLC 用于蛋白质分析时,一般需要低pH值流动相、较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分 ,氟乙酸(TFA)作为离子对试剂 ,是反相色谱中最常用的添加剂——蛋白质的保留性质和选择性与 反相色谱键合固定相的性质有关。随着研究的深入,越来越多的小分子蛋白质和多肽已经能够使用RP-HPLC进行分离 分 析 2.2 高效亲和色谱 (HPAFC) HPAFC的基本原理是抗原抗体反应 ,它可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质 ,特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化。HPAFC可以分离纯化酶、抗体、抗原、结合蛋白、受体蛋白、辅助蛋白等,也可以分离变性蛋白、化学改性蛋白等,在蛋白质化学中起着重要作用.目前乳源性的功能蛋白, 如乳铁蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等 ,都可以用该法得到纯化。 2.3 高效离子交换色谱 (HPIEC) HPIEC是根据蛋白质分子在一定的 DH 和离子强度条件下所带电荷的差异将其分离的。这种技术已经成功地用于分离蛋白质 ,成为分离 、检测蛋白质的重要方法。并且，当选择的流动相的pH值合适时能维持蛋白质的生物活性。由于HPIEC是一吸附性的梯度洗脱过程。所以具有很好的负载力。并且，人们的研究证明,HPIEC 与 RP —HPLC都是分离膜蛋白的首选方法 。在离子交换色谱填料研究方面。聚合 物离子交换剂颇受重视。因为这种固定相具有稳定性好、离子交换容量大、对蛋白质的分离有选择性等特点。 2.3.1 阴离子交换色谱 大多数蛋白质在生理 pH值 6—8时,都带负电 荷 ,因此常用阴离子交换色谱来分离 。如人乳或牛乳中的 骨桥蛋白 , 通常就可以用 pH 值 5.0 -7.0 的弱阴离子交换色谱纯化 。采用阴离子交换色谱分离乳蛋白时 ,一般是有针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好 , 如分离骨桥蛋白时 , 纯 度可以达到 8 5 % 以 上 ,但是如果要将大多数常量蛋白质都同时得到分离,则必须与其他手段 (如膜分离或分子筛)联用。 2.3.2 阳离子交换色谱 对于乳品中一些等电点较高的蛋白质 ,如乳铁蛋白 (Lactoferin),采用强阳离子色谱的分离手段则更为有效 。且在分离乳铁蛋白的同时 ,乳过氧化物酶 (Lactoperoxidase) 也可以得到分离，如将强阳离子交换柱与超滤的方法相结合 ,最终乳铁蛋白的纯度可以达到 94% 2.4 高效凝胶过滤色谱