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分子实验操作手册 目录 第一部分 常用培养基成分及溶液配方法 1 一、常用抗生素贮存液 1 二、LB细菌培养基的配制 1 三、植物培养基的配制 1 三、植物培养基的配制 1 第二部分 分子克隆技术操作 3 一、植物总RNA提取 3 二、基因组DNA的制备 4 三、RT-PCR(Takara Promega) 4 四、PCR 5 五、琼脂糖凝胶电泳 5 六、目的DNA片段回收 5 七、DNA浓缩(乙醇沉淀法) 5 八、目的片段的连接 6 九、细菌感受态细胞的制备 6 十、农杆菌感受态细胞(电转化用)的制备 7 十一、质粒DNA的转化 7 十二、质粒抽提 7 十三、质粒酶切 8 十四、Gateway?技术构建植物表达载体 8 十五、表达载体转化农杆菌感受态细胞 8 十六、SDS 9 十七、Western Blotting 10 十八、烟草转化 11 十九、拟南芥花侵染法 12 二十、原核表达 13 二十一、蛋白纯化 14 二十二、实验室可用资源 15 二十三、试剂级别简称含义 15 二十四、其它 16 张 晓 东 2015年7月0日 一、常用抗生素贮存液 Amp、Km、Spe、Hyg、Cef溶于去离子水中，0.22 μm滤膜过滤，-20保存。 氨苄青霉素(Amp) 100 100 卡那霉素(Km) 50 50 潮霉素(Hyg) 50 20 头孢噻肟钠(Cef) 50 500 壮观霉素(Spe) 100 100 利福平 50 50 工作浓度(mg/ml) ?严紧型质粒(ug/ml) 松驰型质粒(ug/ml) 羧苄青霉素 50(溶于水) 20 60 氯霉素 25(溶于无水乙醇) 25 170 链霉素 10(溶于水) 10 50 四环素 10(溶于甲醇) 10 50 二、LB细菌培养基的配制 按LB培养基成分称取试剂，置于1L烧杯中，LB培养基主要成分(表2.2)； 组分 200ml 300ml 400ml 500ml 600ml 700ml 800ml 1000ml Tryptone 2g 3g 4g 5g 6g 7g 8g 10g Yeast Extract 1g 1.5g 2g 2.5g 3g 3.5g 4g 5g NaCl 2g 3g 4g 5g 6g 7g 8g 10g 2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解； 3、滴加2 M/L NaOH，调节pH值至7.0； 4、加入去离子水定容至1 L，如果是固体培养基要加入琼脂粉使最终浓度为1.5%； 5、121℃高压灭菌20 min，4℃保存。 （2）酵母培养基 Tryptone 4g 6g 8g 10g 12g 14g 16g 20g Yeast Extract 2g 3g 4g 5g 6g 7g 8g 10g Glycose 4g 6g 8g 10g 12g 14g 16g 20g 加蒸馏水定容pH6.0，葡萄糖115 ℃，20 min灭菌 三、植物培养基的配制 实验中，植物根诱导培养基为MS，芽诱导培养基为MS4。 注意： 0、以下Stock配完后可直接使用，不需要稀释！ 配制IBA时，先溶于少量95 %乙醇，然后加去离子水混匀定容到200 ml； NAA、6BA：先使用少量NaOH溶解，然后加水定容到200 ml； 激素溶液储液应使用直径0.22 μM的滤膜过滤除菌后，-20℃保存。 2 M、3 M醋酸钠配制时，使用去离子水溶解，冰乙酸调节pH，可高温灭菌。 植物培养基贮液配制一览表(1*Stock) 贮液 成分 200 ml 备注 Stock 1 NH4NO3 33g KNO3 38g Stock 2 MgSO4.7H2O 7.4g MgSO4.6H2O 6.798 g KH2PO4 3.4g Stock 3 CaCl2.2H2O 8.8g Stock 4 Na2.EDTA 0.746g FeSO4.7H2O 0.556g Stock 5 H3BO4 0.124g MnSO4.4H2O 0.446g MnSO4.H2O 0.338 g ZnSO4.4H2O 0.172g ZnSO4.7H2O 0.212 g KI 0.017g Na2MoO4.2H2O 0.005g CuSO4.2H2O 0.5mg CuSO4 0.41 mg CoCl2.6H2O 0.5mg Stock 6 Thiamine-HCl氯化硫胺素 0.02g Inositol肌醇 2g Glycine甘氨酸 0.04g Pyridoxine-HCl盐酸吡哆醇 0.01g Nicotinic acid烟酸、尼克酸 0.01g Sto