讲稿1_蛋白质的分离纯化_.pdf

第三节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分离纯化 一、蛋白质分离纯化的一般原则： 一、蛋白质分离纯化的一般原则： 蛋白质纯化的总目标 增加制品的纯度或比活 (1)前处理：把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态 骤 步 化 纯 离 分 的 质 白 蛋 释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生 物活性。 (2)粗分级分离：将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。 (3)细分级分离：样品的进一步纯化。 (4)结晶：是蛋白质分离纯化的最后步骤。 1、前处理： 组织和细胞的破碎 电动捣碎机（Waring blender ） 动物组织和细胞： 匀浆器破碎 超声波处理（u1trasonication） 研磨的方法破碎 植物组织和细胞： 纤维素酶处理 超声波震荡 与砂研磨 细菌细胞的破碎： 高压挤压 溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等 提取蛋白液 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 2、粗分级分离 盐析 简便 方法 等电点沉淀 特点 处理量大 有机溶剂分级分离 既能除去大量杂质（包括脱 盐），又能浓缩蛋白质溶液 蛋白质提取液体积较大，则可采用 超过滤 凝胶过滤 冷冻真空干燥 或其他方法（如聚乙二醇浓缩法） 3、细分级分离 凝胶过滤 离子交换层析 一般使用层析法 包括 吸附层析 亲和层析等 区带电泳 必要时还可选择电泳法 等电聚焦等 作为最后的纯化步骤。 用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 结晶 是蛋白质分离纯化的最后步骤。 蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状 态的有力指标。 蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 结晶的最佳条件是: 使溶液略处于过饱和状态 二、蛋白质的分离纯化方法 二、蛋白质的分离纯化方法 透析和超过滤： 分子大小 密度梯度（区带）离心 凝胶过滤 等电点沉淀和pH