第三章 分子克隆工具酶.pdf

3 分子克隆工具酶（4学时） 概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase ） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶 工具酶的定义  在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和 RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。  基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。 常用的工具酶  工具酶 名称 主 要 功 能 限制性核酸内切酶 在DNA分子内部的特异性的 restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割 DNA连接酶 将两条以上的线性DNA分子或片段 DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体 DNA聚合酶I 通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链 DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性 多核苷酸激酶 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 DNA polymerase kinease 5’ －OH末端上 反转录酶 以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链 reverse transcriptase DNA末端转移酶 将寡聚物尾巴加到了线性双链 DNA terminal Deoxynuc 或单链DNA分子的3’ －OH末端或DNA的3’ －末端 leatidy transferase (接下 表格)  常用的工具酶 (续上表格) 工具 酶 名 称 主 要 功 能 碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团 BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3’ －OH末端的核苷酸残基 exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链 核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸 nuclease Bal31 Taq DNA 聚合酶 能在高温（72℃ ）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA RNase 脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase 2.1 限制性内切酶 (restriction enzyme)  限制与修饰（Restriction and modification ）  限制酶识别的序列  限制酶产生的末端  DNA末端长度对限制酶切割的影响  位点偏爱（Site preference ）  酶切反应条件  星星活性（star activity ）  单链 DNA 的切割  酶切位点的引入  影响酶活性的因素  酶切位点在基因组中分布的不均一性 2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ） 1.限制性内切酶的发现 1968年，Meselson从E.coli K株中分离