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（二）细胞因子检测 （一）生物学方法 原理：根据不同细胞因子生物学活性（功能)不同而设计的方法 如IL-2可促进T淋巴细胞生长； TNF可杀肿瘤细胞； CSF可刺激造血细胞形成集落； IFN可保护细胞免受病毒攻击。 具体方法： 细胞增殖法 靶细胞杀伤法 诱导的产物分析法 细胞病变抑制法 所用抗原：OT 或 PPD 以OT为例： OT 1:2000 0.1ml 皮内注射，48—72h 观察结果。 红肿硬结直径大于 0.5cm，为阳性 作用及意义： a.是B细胞的表面标志 b.是B细胞识别抗原的受体 c.检测外周血淋巴细胞时，表面有SmIg者为 B细胞，故可作为检测B细胞数量的方法。 （2）同位素掺入法（ 3H-TdR掺入法） 原理： T细胞受PHA刺激后，细胞进入增殖周期,发生有丝分裂合成DNA。试验中当细胞进入S期时，在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)，细胞摄入，合成DNA,根据掺入细胞内的同位素量，推测细胞增殖程度，从而判断T淋巴细胞转化程度。 步骤： 外周血 分离 淋巴细胞 洗涤3次 计数并配成1×106/ml 0.1ml细胞+1640 0.1ml+PHA0.5mg/ml 37 °C 54-56h 5%co2 加3H-TdR 1μci/孔 37 °C 16-18h 5%co2 收集细胞于滤膜上 80~85 °C 30分钟 置有闪烁液的闪烁瓶中 用? 闪烁计数仪测cpm（每分钟脉冲数） 计算刺激指数： 刺激指数(SI) = 实验组cpm 对照组cpm 正常值：SI ? 3.0 同位素掺入法的优缺点 优点： 结果客观准确，有取代形态学法的趋势 缺点： 技术要求高，操作中每一个因素的改变都可影响结果；需要特殊仪器检测；有同位素污染问题 （3）MTT比色法 MTT— 四甲基偶氮唑盐 淋巴细胞受刺激物刺激培养过程中，细胞增殖活化，在细胞培养终止前4~6小时，加入MTT，继续培养。 MTT在细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的作用下，被还原成蓝黑色的MTT-甲瓒，形成的MTT-甲瓒量与细胞增殖呈正相关。 终止培养后加入二甲亚砜，使MTT-甲瓒溶解。在酶标仪上测A570nm，可反映细胞增殖水平。 以刺激指数（SI）判断淋巴细胞增殖程度。 SI = 试验孔A570nm/对照孔A570nm 本法敏感性不及3H-TdR掺入法，但操作简单，无放射性污染。 细胞因子的检测应注意的问题 1.欲了解免疫功能情况，应检测多项细胞因子，如细胞免疫应测IL-2、IL-4、GM-CSF等 2.局部取标本：细胞因子由局部细胞产生，在血液中浓度极低，最好取局部体液或细胞 3.动态检测比较，如疾病的复发期、缓解期、恢复期 4.同一细胞因子选用多种方法检测，生物活性检测与其他方法检测结果不一定平衡（一个是功能，一个是量） 细胞因子检测方法 生物学方法 免疫学方法 分子生物学方法 1.细胞增殖法 原理： 一些细胞因子可专一刺激某些细胞增殖，而且细胞增殖的程度与这些细胞因子活性呈正相关。 如：IL-2 —— T细胞， IL-3 ——肥大细胞，IL-6 ——浆细胞。 这些只依赖某种细胞因子才能生长的细胞系又称为依赖细胞株。 如人IL-2对鼠T细胞有支持生长作用 一定数量鼠T细胞+ 每孔分别加不同剂量的IL-2 培 养 根据鼠T细胞生长情况，可制作IL-2的标准曲线 （数孔） 2.靶细胞杀伤法 有的细胞因子能杀伤靶细胞（肿瘤细胞），利用同位素释放法或染色法等可判定其杀伤率 3.细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定的细胞产生生物活性物质，通过测定其诱生产物来反映细胞因子活性 如IL-2、IL-3可诱导骨髓产生组胺； IL-6诱导肝细胞产生?-抗糜蛋白酶； 4.细胞病变抑制法 干扰素可阻止病毒侵害细胞，可用相关试验来检测验干扰素含量。 如血凝素生成抑制试验： 小鼠脑脊髓心肌炎病毒可感染人肺癌A549细胞，该病毒在生长过程中可产生血凝素，使人O型RBC凝集 试验管：A549细胞（已长好） 加一定量干扰素 培养一定时间 加病毒 培养 反复冻融 稀释不同倍数 加O型血球 观察凝集情况 阳性对照加标准IFN；阴性对照不加IFN。 在IFN标准剂量曲线上查出IFN量 （二）免疫学检测法 细胞因子为蛋白质或多肽，具有较强的免疫原性，可用其特异抗体来检测。最常用的检测方法是ELISA和放免法、化学发光法。 定量测定 （三）分子生物