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分子生物学大实验生物技术专业2010年08月 课程特点： 课程分为集中授课和实验操作两部分（详见时间安排）； 实验时间长，集中，强度较大； 实验操作要求高，涉及的基本操作技能技巧较多； 实验中将接触一些有毒试剂（如E.B.和氯仿）； 理论较抽象，有一定难度。 课程要求： 掌握实验原理，实践、熟悉并规范分子生物学主要的技术操作，学习药品及培养基配制方法。 实验前充分做好预习和各种准备，熟悉实验指导中的实验操作过程，准备一个实验记录本； 穿实验服，实验操作认真仔细，小心有毒药品的使用； 组内做好安排和协调，相互协作，互相谦让； 遵守时间，遵守纪律，不在实验室内大声喧哗，不做与实验无关的事情。 分子生物学主要技术 DNA、RNA的分离提取 质粒DNA的分离提取 感受态细胞的制备及质粒连接、转化和筛选 DNA酶切及重组 PCR 核酸及蛋白质杂交 实验一：琼脂糖凝胶电泳 概述： 一、琼脂糖和琼脂糖凝胶： 琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1→3）和（1 → 4）糖苷键交替构成的线状聚合物。 琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。 二、下述因素决定DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率： DNA分子大小： 双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移越慢。 琼脂糖浓度： 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。浓度越高，迁移越慢。 DNA构象： 超螺旋环状、切口环状和线状DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。（主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，还有电流强度、缓冲液离子强度和超螺旋程度） 大多数情况，主要区别未处理的环状DNA样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一DNA样品。 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭： 溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线状DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%。 所用电压： 低电压时，DNA片段迁移率与所用电压成正比。 琼脂糖种类：见表1 电泳缓冲液： DNA的泳动受电泳缓冲液组成和离子强度的影响。 适用于天然双链DNA的电泳： TAE buffer（E buffer） TPE buffer TBE buffer 表1 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 三、凝胶载样缓冲液（loading buffer）： 临上样前将样品和loading buffer进行混合。 loading buffer作用： 1、增加样品密度，以保证DNA沉入加样孔内； 2、使样品带有颜色，简化上样过程； 3、其中的染料（溴酚蓝、二甲苯氰FF）在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移，这一特性与琼脂糖浓度无关。 实验目的： 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法； 学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。 实验原理： DNA分子在碱性环境中（pH8.3 buffer）带负电荷，在外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率不同，从而可以区分不同的区带。电泳后经溴乙锭（E.B.）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。溴乙锭检测DNA灵敏度很高，10ng或更少的DNA即可检出。 线性DNA在凝胶中迁移距离（迁移率）与它的分子量大小的对数成正比。将未知大小DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物（DNA Marker）的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。 实验方法： 1、用胶带或插板封住塑料托盘开放的两边形成一个模具，置于水平工作台上，将梳子插入模具，梳子距模具一端约1cm，梳齿底端距托盘表面保持0.5-1mm的间隙。 2、称取0.4g琼脂糖置于三角瓶中,加入40ml TAE buffer以配制1%的凝胶，使用电炉子加热直至琼脂糖完全熔化，期间轻轻摇匀。 3、待琼脂糖冷却至65℃左右(滴入E.B. 至终浓度为0.5μg/ml，轻轻摇匀，避免产生气泡)，小心缓慢倒入模具内（避免产生气泡），使凝胶缓慢展开直至在托板表面形成一层约3mm厚的均匀胶层，室温下静置0.5-1h。 4、待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出梳子（注意切勿使样品槽破裂），在胶板上形成相互隔开的样品槽。 5、将凝胶连同托板放入电泳槽平台上，倒入适量TAE buffer直至浸没过胶面2-3mm，小心除去样品槽中的气泡。 6、用微量加样器取样品（或DNA Marker）20ul，取6×loading buffer 5ul，与样品（或DNA Marker）缓慢混合均匀（避免气泡），将混合样加入样品槽内（注意避免因