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云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量固相萃取-高效液相色谱法测 　 作者：孔繁晟， 严春艳， 庞小雄， 贲永光 【摘要】 目的建立以固相萃取-高效液相色谱（HPLC）法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。方法固相萃取柱：Agilent ODS C18 500 mg/3 ml; 色谱柱：Agilent zorbax SB-C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇－水－乙腈（35∶55∶10），流速1.0 ml·min-1，检测波长227 nm，柱温30℃。结果10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在 1.6～8.0 μg·ml-1范围内，进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 9，平均回收率为96.8％，RSD为 4.8 %(n= 6)。结论该方法可用于云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定，方法稳定，结果准确、可靠。 【关键词】 固相萃取-高效液相色谱法； 红豆杉； 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ 　云南红豆杉Taxus yunnanensis中的抗肿瘤化合物主要是以紫杉醇(Taxol)为代表的二萜类紫杉烷化合物，红豆杉中紫杉醇含量极低，且从树皮中分离会对植物资源造成破坏。10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-DAB Ⅲ）是云南红豆杉中的紫杉烷类二萜化合物，其本身具有很好的抗癌活性，同时也是合成紫杉醇的前体物［1］，且从枝叶中即可获得，故对其进行开发利用既可保护稀有树种红豆杉，同时对提高资源利用率有着积极意义。我们建立了固相萃取-高效液相色谱（SPE -HPLC）法，对云南红豆杉枝叶中10-DAB Ⅲ进行含量测定。 　　1 试剂与试药 　　Agilent 1100高效液相色谱仪; 固相柱：Agilent ODS C18 500 mg/3 ml;Sartorius Cp3245型天平；KQ-500DE型医用数控超声仪（江苏昆山超声仪器有限公司）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)；LABOROTA 4000旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司); LG10-2.4A离心机(北京医用离心机厂)。10-DAB Ⅲ对照品（Sigma公司产品，纯度gt;99%）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；药材采自云南大理云龙县, 经南方医科大学生药学教研室鉴定为云南红豆杉Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu的枝叶。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件色谱柱为Agilent zorbax SB- C18( 250 mm×4.6 mm，5 μｍ）；流动相为甲醇－水－乙腈（35∶55∶10），流速1.0 ml·min-1，检测波长227 nm，柱温30℃，进样量10 μl，检测器灵敏度0.04 AUFS。 　　2.2 供试品溶液的配制 精密称取云南红豆杉药材粉末10.0 g，醋酸乙酯∶丙酮（1∶1）60 ml，超声提取30 min， 离心10 min，取清液减压干燥，提取物以石油醚脱色，重复操作1次，提取物备用。取固相萃取小柱，加入甲醇20 ml，抽干洗柱，以0.01 mol/L的乙酸铵溶液湿润固相萃取柱；提取物溶于80％甲醇乙酸铵溶液，上柱，抽干，依次用0.01 mol/L的乙酸铵20 ml淋洗，抽干；40％的甲醇乙酸铵溶液40 ml，淋洗，抽干；80％的甲醇乙酸铵溶液40 ml，淋洗，收集洗脱液，减压干燥，干燥物用甲醇溶解，定容至5 ml，甲醇液经0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。 　　2.3 对照品溶液的配置精密称取10-DAB Ⅲ对照品10 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超声振荡使溶解，放冷至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，配成0.4 mg·ml-1的对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，滤液作为对照品溶液待用。 　　　2.4 线性关系考察取上述对照品溶液，精密吸取 4，8，12，16，20 μl进样，按上述色谱条件作 HPLC 分析，以进样量m为横坐标，峰面积值A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程式： 　　A=180.9 m-75.1 r=0.999 9 　　结果表明，在实验条件下10-DAB Ⅲ在 1.6～8.0 μg范围内，进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系。 　　2.5 精密度实验取对照品溶液按上述色谱条件连续进样6次，记录10-DAB Ⅲ的峰面积，计算相对标准偏差。结果RSD为2.78%，表明色谱系统精密度良好。 　　2.6 稳定性实验按上述色谱条件，在配制供试品溶液后的 0，1，3，6，9，12 h分别进样，记录峰面积，计算相对标准偏差，结果RSD为2.80％，表明供试品溶液在 12 h内稳定。 　　2.7 重复性实验取云南红豆杉枝叶6份(批号060310)，每份 5ｇ，精密称定按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.1