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云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量固相萃取-高效液相色谱法测
云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量固相萃取-高效液相色谱法测 作者:孔繁晟, 严春艳, 庞小雄, 贲永光 【摘要】 目的建立以固相萃取-高效液相色谱(HPLC)法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。方法固相萃取柱:Agilent ODS C18 500 mg/3 ml; 色谱柱:Agilent zorbax SB-C18( 250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:甲醇-水-乙腈(35∶55∶10),流速1.0 ml·min-1,检测波长227 nm,柱温30℃。结果10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在 1.6~8.0 μg·ml-1范围内,进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 9,平均回收率为96.8%,RSD为 4.8 %(n= 6)。结论该方法可用于云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定,方法稳定,结果准确、可靠。 【关键词】 固相萃取-高效液相色谱法; 红豆杉; 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ 云南红豆杉Taxus yunnanensis中的抗肿瘤化合物主要是以紫杉醇(Taxol)为代表的二萜类紫杉烷化合物,红豆杉中紫杉醇含量极低,且从树皮中分离会对植物资源造成破坏。10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB Ⅲ)是云南红豆杉中的紫杉烷类二萜化合物,其本身具有很好的抗癌活性,同时也是合成紫杉醇的前体物[1],且从枝叶中即可获得,故对其进行开发利用既可保护稀有树种红豆杉,同时对提高资源利用率有着积极意义。我们建立了固相萃取-高效液相色谱(SPE -HPLC)法,对云南红豆杉枝叶中10-DAB Ⅲ进行含量测定。 1 试剂与试药 Agilent 1100高效液相色谱仪; 固相柱:Agilent ODS C18 500 mg/3 ml;Sartorius Cp3245型天平;KQ-500DE型医用数控超声仪(江苏昆山超声仪器有限公司);DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司);LABOROTA 4000旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司); LG10-2.4A离心机(北京医用离心机厂)。10-DAB Ⅲ对照品(Sigma公司产品,纯度gt;99%);甲醇为色谱纯;其余试剂均为分析纯;药材采自云南大理云龙县, 经南方医科大学生药学教研室鉴定为云南红豆杉Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu的枝叶。 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为Agilent zorbax SB- C18( 250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-水-乙腈(35∶55∶10),流速1.0 ml·min-1,检测波长227 nm,柱温30℃,进样量10 μl,检测器灵敏度0.04 AUFS。 2.2 供试品溶液的配制 精密称取云南红豆杉药材粉末10.0 g,醋酸乙酯∶丙酮(1∶1)60 ml,超声提取30 min, 离心10 min,取清液减压干燥,提取物以石油醚脱色,重复操作1次,提取物备用。取固相萃取小柱,加入甲醇20 ml,抽干洗柱,以0.01 mol/L的乙酸铵溶液湿润固相萃取柱;提取物溶于80%甲醇乙酸铵溶液,上柱,抽干,依次用0.01 mol/L的乙酸铵20 ml淋洗,抽干;40%的甲醇乙酸铵溶液40 ml,淋洗,抽干;80%的甲醇乙酸铵溶液40 ml,淋洗,收集洗脱液,减压干燥,干燥物用甲醇溶解,定容至5 ml,甲醇液经0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。 2.3 对照品溶液的配置精密称取10-DAB Ⅲ对照品10 mg,置25 ml容量瓶中,加甲醇20 ml,超声振荡使溶解,放冷至室温,甲醇定容至刻度,摇匀,配成0.4 mg·ml-1的对照品溶液,过0.45 μm微孔滤膜,滤液作为对照品溶液待用。 2.4 线性关系考察取上述对照品溶液,精密吸取 4,8,12,16,20 μl进样,按上述色谱条件作 HPLC 分析,以进样量m为横坐标,峰面积值A为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程式: A=180.9 m-75.1 r=0.999 9 结果表明,在实验条件下10-DAB Ⅲ在 1.6~8.0 μg范围内,进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系。 2.5 精密度实验取对照品溶液按上述色谱条件连续进样6次,记录10-DAB Ⅲ的峰面积,计算相对标准偏差。结果RSD为2.78%,表明色谱系统精密度良好。 2.6 稳定性实验按上述色谱条件,在配制供试品溶液后的 0,1,3,6,9,12 h分别进样,记录峰面积,计算相对标准偏差,结果RSD为2.80%,表明供试品溶液在 12 h内稳定。 2.7 重复性实验取云南红豆杉枝叶6份(批号060310),每份 5g,精密称定按“2.2”项下方法制备样品溶液,按“2.1
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