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下肢缺血预处理对大鼠心肌基因表达影响 　 作者：张冬会 赵晓云 邢邯英 卢亚敏 庞国勋 司翠权 【摘要】 目的 通过观察经下肢缺血预处理的心肌梗死大鼠心肌中缺氧诱导因子1α（HIF1α）和血红素加氧酶1（HO1）mRNA的表达，探讨其在缺血心肌中的作用。方法 将SD雄性大鼠随机分为心肌梗死组（40只）和下肢缺血预处理组（40只）；每组按缺血时间又分为1、2、4、6、12 h组。显微镜下计数外周血白细胞；HE染色观察心肌组织中浸润白细胞的数值。应用逆转录多聚酶链反应（RTPCR）测定术后各时间点心肌组织中HIF1α和HO1mRNA表达。结果 下肢缺血预处理后12 h组外周血白细胞计数以及心肌组织中白细胞浸润数目较心梗组显著减少（P＜0.05）；心肌中1、2、4 h HIF1α mRNA表达与心梗组对应时间点比较有显著差异（P＜0.01）。各时间点HO1mRNA表达与心梗组对应时间点比较有显著差异（P＜0.01）。 结论 经下肢缺血预处理后，心肌损伤减轻，HIF1α和HO1可能与心肌保护作用有关。 【关键词】 下肢； 缺血预处理；心肌梗死 目前，心肌缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)已从心脏扩展到心外组织，如下肢、肾脏、骨骼肌等，其短暂缺血不仅能减轻局部组织或器官的缺血损伤，而且对远隔组织和器官也有保护作用，被证明是最有效的内源性心肌保护机制。Ockaili等〔1〕的研究表明，缺氧诱导因子1α（HIF1α）诱导的血红素加氧酶1（HO1）表达上调对缺血心肌有保护作用。但有关HIF1α和HO1mRNA在下肢缺血预处理中的作用机制尚未明了。本研究旨在阐述这两种基因在下肢缺血预处理对心肌梗死大鼠心肌的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 主要试剂：逆转录酶（AMVRT ）、dNTP、Taq DNA聚合酶、随机引物、琼脂糖均购自美国Promega 公司。HIF1α、HO1 及βactin 上下游引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器：奥林帕斯显微镜（日本）；数字彩色显微图像分析系统、PCR 扩增仪(PE5700)（美国）。 　　1.2 动物分组与模型制作 选择雄性SD大鼠80只，体重250～300 g，由河北医科大学动物实验中心提供。所有大鼠实验前适应性饲养1 w，室温（25±3）℃，随机分为2组。(1) 急性心肌梗死（AMI）组：开胸并暴露大鼠心脏,结扎左冠状动脉前降支(LAD)。(2)下肢缺血预处理（LIP）组：分离双侧股动脉，动脉夹夹闭双侧股动脉5 min，开放5 min，反复4次，随后进行LAD结扎。各组均在操作结束后1、2、4、6、12 h处死大鼠。每组每个时间点8只。心脏取血计数外周血白细胞，取心尖部分提取总RNA，另取部分心肌组织固定包埋行HE染色。 　　1.3 HIF1α和HO1 mRNA表达水平的检测 　　1.3.1 总RNA提取 Trizol一步法提取组织总RNA。紫外分光光度计测RNA 的吸收度(A)值，A260/A280＞1.8认为RNA 较好无降解。采用20 μl反应体系：总RNA 2 μg，随机引物1 μl，加去离子水补至10 μl，70℃水浴5 min，迅速放冰上5 min。然后再加MMLV 1 μl，RNA酶抑制剂1 μl，4×dNTP 1 μl，5×MMLV缓冲液4 μl，37℃水浴4 h合成cDNA，所得cDNA-20℃保存。 　　1.3.2 目的基因PCR扩增 向优化体系中加入以下成分：引物1、2各5 pmol/L，cDNA 2 μl，去离子水补足20 μl。在扩增仪上进行RTPCR，PCR的反应参数：HIF1α 95℃5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，68℃ 1 min，循环35次；68℃延伸5 min。HO1为94℃ 2 min；94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，循环35次； 72℃延伸5 min。 βactin为94℃ 5 min；94℃ 35 s，56℃ 35 s，72℃ 35 s，循环35次；72℃延伸5 min。 4℃终止反应。 　　1.3.3 RTPCR产物半定量 取RTPCR产物8 μl行1.5%琼脂糖凝胶电泳，80 V，45 min，目的基因扩增产物与βactin扩增产物灰密度扫描之比作为目的基因的相对表达量。应用UVP凝胶成像分析系统分析实验结果。引物序列及扩增片段长度见表1。 　　表1 RTPCR反应引物序列及扩增片段长度（略） 　　1.4 统计学处理 实验数据用x±s表示,采用SPSS13.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析,如有显著性差异,再进一步用组间两两比较q检验。 　　2 结果 　　2.1 组间外周血白细胞