GPI锚定修饰慢粒白血病bcr-abl及鼠IL12真核双表达质粒构建.docVIP

GPI锚定修饰慢粒白血病bcr/abl及鼠IL12真核双表达质粒构建 　 作者：陶崑，王东，曾建明，黄世峰，陈新敏，曹唯希，黄宗干，冯文莉 【摘要】 目的： 构建由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的bcr/abl和鼠IL12（mIL12）真核双表达质粒，在COS7细胞中检测其基因和膜蛋白表达. 方法： 以含有慢粒白血病（b3a2型）migP210全长序列的质粒为模板，通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段，酶切后插入pBudCE4.1空载中，经鉴定获得重组质粒pBB. 同时，RTPCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI锚定序列，酶切后克隆入pBB质粒中与bcr/abl基因片断羧基端相连，获得重组质粒pBBG并鉴定. 然后扩增mIL12基因片段并亚克隆入pBBG另一多克隆位点，构建重组质粒pBBGI. 在多聚阳离子介导下将pBBGI质粒转染COS7细胞，采用RTPCR, Western Blot检测bcr/abl融合基因及其蛋白的表达，ELISA检测mIL12的表达. 结果： 经酶切和测序鉴定证实，由GPI锚定连接的bcr/abl及mIL12基因插入片段正确；转染细胞中有bcr/abl融合基因、转染细胞膜上有bcr/abl融合蛋白的表达，细胞培养上清中也有mIL12的表达. 结论： 成功构建能在真核细胞中表达bcr/abl和mIL12的重组质粒PBBGI，为进一步研究bcr/abl基因疫苗诱导肿瘤特异性细胞免疫奠定了基础. 【关键词】 bcr/abl融合基因；糖基磷脂酰肌醇类；白细胞介素12；真核双表达 0引言 　　慢性粒细胞白血病(CML)的细胞遗传学特征是具有Ph染色体，即t(9；22)(q34．1；q11．2)，形成bcr/abl融合基因并表达具有强烈酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白，后者使造血干细胞异常转化而导致CML发生. p210融合蛋白属于肿瘤特异性抗原，其抗原性由bcr/abl基因的融合区域决定. 然而，bcr/abl融合蛋白是CML细胞的胞内蛋白，如何将其有效递呈到CML细胞膜表面从而持续诱导特异性细胞免疫并成为效应CTL细胞的靶向分子，一直是国内外研究的热点. 人外周血淋巴细胞表面CD24分子中含有一种特定的GPI锚定序列，它能通过其糖基化磷脂酰肌醇结构将重组蛋白锚定于细胞膜上［1-2］. 而IL12是目前最强的诱导细胞免疫活性和调节作用的细胞因子［3］. 本研究旨在构建一种真核双表达质粒使bcr/abl融合蛋白通过GPI的锚定修饰作用表达于细胞膜上而持续刺激机体产生免疫应答，同时利用mIL12增强细胞免疫效应，为下一步应用该核酸疫苗诱导肿瘤特异性免疫应答奠定基础. 1材料和方法 1.1材料真核双表达载体pBudCE4.1购自Invitrogen公司；含有编码慢粒白血病bcr/abl融合蛋白全长序列（b3a2型）的migP210质粒为本室保存；小鼠单链IL12质粒(Elasti)由本室曾建明博士赠送；COS7细胞由重庆医科大学感染性疾病分子生物学实验室赠送. 质粒抽提纯化、胶回收、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物公司；限制性内切酶、cDNA逆转录试剂盒、快速连接试剂盒、Primstar酶及其他PCR试剂购自TaKaRa公司；RNA提取试剂、琼脂糖等购自上海生工生物工程公司；RPMI1640和胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司；DAB显色试剂盒和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自Santa Cruz生物技术有限公司；NC膜购自北方同正生物技术发展公司；膜蛋白提取试剂盒为南京凯基生物技术有限公司产品；转染试剂jetpEITM为POLYplus transfection公司产品；小鼠IL12 P70ELISA检测试剂盒为美国Ramp;D公司产品. 1.2方法 1.2.1pBudCE4.1bcr/abl重组质粒的构建及鉴定根据登录GenBank Granulysin编码序列NM005157，设计引物扩增bcr/abl 融合基因片段，约654 bp. 上游引物P1： 5′GCAAGCTTACCATGGACATCCGTGG3′；下游引物P2： 5′GTCGACCTTGCCATCAGAAGC3′. 引物由上海生工生物工程公司合成. 以含有编码bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板，进行PCR扩增. 反应体系如下：模板1.5 μL, 5×缓冲液6 μL, dNTP 2.4 μL，P1, P2各2 μL，Primstar酶0.3 μL，灭菌去离子水15.8 μL，共30 μL. 扩增条件：94℃ 5 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 55 s，共32个循环；72℃ 5 min. PCR产物