第三章生物材料的预处理，细胞破碎和液-固分离.docVIP

　 第三章 生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离　　 3.1 生物材料的预处理　 生物活性物质主要来自动物，植物，微生物的组织、器官、细胞及代谢产物。一般况下，可根据生物活性物质存在部位和分布方式分为“胞内”与“胞外”两种，但无论目的产物存在于“胞内”还是“胞外”，通常浓度是很低的，杂质含量却很高，而且生理活性越高的成分，其含量往往越低。如胰岛素在胰脏中的含量为0．02％，胆汁中胆红素含量为0.05％~0．08％，而一些含量更低的生理活性物质用传统的直接提取的方法没有太大工业价值。因此需用现代生物技术来解决这一难题，通过微生物工程、细胞工程、基因工程和酶工程等技术使生物活性物质富集在细胞、发酵液或酶转化液中，大幅度降低生产成本。例如通过遗传选育等方法得到抗生素高产菌，可使发酵液中抗生素的含量一般达到10～30kg／m3；利用基因工程技术，可使目的蛋白占到细胞总蛋白的50％以上。尽管如此，发酵代谢物中生物活性物质含量还是较低的，存在大量的菌体细胞、未用完的培养基、各种蛋白质胶状物、色素、金属离子以及其他代谢产物等。这些杂质有些是可溶的，有些是不可溶的，它们都会影响目的产物的有效提取，所以培养液的预处理和细胞回收是进行分离纯化的必须工序。通过预处理去除大部分杂质，使得提取工序能够顺利进行。　 一、确定预处理方法的依据　　　γ一球蛋白来自B淋巴细胞。多数微生物酶如淀粉酶、蛋白质水解酶、糖化酶常大量存在于胞外培养液中。而合成酶类、代谢酶类、遗传物质和代谢中间产物则存在于细胞内，如DNA聚合酶、细胞色素C等。真核细胞的DNA大部分存在于细胞核内，只有少量存在于线粒体和微粒体中，而RNA则主要存在于胞质中，电子传递系统物质包括黄素蛋白、细胞色素类以及糖类，脂肪酸合成、氧化和氧化磷酸化有关的酶系大部分存在于线粒体中。消化酶虽然可分泌到胞外，但难以从消化道进行收集，只能由相应的腺体提取分离，而且这些酶在细胞内刚合成时常常是以无活性的酶原形式存在，提取时需要预激活。如胰蛋白酶、糜蛋白酶等都是以酶原的形式存在于胰脏中，在提取制备过程中需活化。目前常采用的方式有两种，一种是提取前先通过预处理加入活化剂和保护剂，在一定温度下放置一段时间使其激活成有活性的酶，然后再分离纯化；另一种方式是先以酶原的形式初步提纯，然后加入激活剂等活化，再通过精制纯化得到有活性的酶类产品。细胞内的生物活性物质有些游离在胞浆中，有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。对于胞内物质的提取要先破碎细胞，对于膜上物质则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。有少数的抗生素如属于多烯类的制霉菌素、两性霉素和曲古霉素产生后都累积于菌丝体内，且水溶性很小，提取时需要获得其菌体滤饼，再用其他溶剂萃取。　　 生物材料中的化学组成十分复杂。不同生物含有不同种类的活性物质。同种生物，在细胞与细胞之间，组织与组织之间，由于细胞的类型、年龄、分化程度的不同，都会改变活性物质的组成。尤其是色素类物质和某些生理活性成分的种类与组成在不同生物间的差别更大。如植物含叶绿素、胡萝卜素、花色素类；动物与微生物含细胞色素、原卟啉；藻类含藻胆色素；脊椎动物含脊椎动物激素：ACTH、MSH、后叶激素、胰岛紊、肾上腺素、甲状腺素、甾体激素；无脊椎动物含蜕皮激素(变态激素)。和促幼激素及外激素(又称信息素，如蚕的性外激素与蚂蚁的报警激素)；植物含吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、乙烯、赤霉素等植物激素。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ph6.5的缓冲液中，在0℃下一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃丙酮内，10min后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。　 四、生物法　 1.酶解法　 酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的化学键，以达到破壁的目的。酶解的方法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。酶解法优点是：①产品释放的选择性高；②抽提的速率和收率快；③产品的破坏少；④对pH和温度等外界条件要求低；⑤不残留细胞碎片。但是酶解法费用较高，若在超滤反应器中使用可溶性固定化酶可望解决酶费用问题。　 因单一酶不易降解细胞壁，需要选择适宜的酶及酶反应系统，并要控制特定的反应条件。某些微生物体可能仅在生长的某一阶段或生长处于特定的情况下，对酶解才是灵敏的。有时，还需附加其他的处理，如辐射，渗透压冲击，反复冻融等或加金属螯合剂EDTA，除去与膜蛋白结合的金属离子，暴露出对酶解敏感的结构部分，也可以利用生物因素以促进活性，变得对酶解作用敏感。对于微生物细胞，常用的酶是溶解酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的B-1,4糖甘键，使脂多糖分解，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中，细