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人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备 [适用对象] 生物工程专业 [实验学时] 6学时 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。 2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。向标本。 三、仪器设备 显微镜，离心机，水浴箱，温箱，锥形离心管，毛细滴管，量简，烧杯，培养瓶，冷湿载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，定时钟，天平。 四、相关知识点 （一）细胞培养技术 1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。 2、无菌操作的要领和要求 1）培养前准备? 为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。 2）超净工作台消毒? 打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。 3）洗手? 操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。 4）火焰消毒? 在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。烧过的用具都要待冷却后再接触细胞，否则会烧焦形成炭膜，再用时会把有害物质带入培养液中。 5）操作? 进行培养操作时动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动增加污染机会。不能用手触及器皿的消毒部分。如已接触，要用火焰烧灼消毒或更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理布局。原则上是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧；酒精灯置于中央。培养液等不要过早开瓶，打开的培养液和培养用瓶等应保持斜位或平放，长时间开口直立，易增加落菌机会。吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。 （二）染色体 染色体是生物细胞中的一个重要的组成部分，每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体。染色体能通过细胞分裂而复制。并且在世代相传的过程中具有稳定地保持形态、结构和功能的特征。染色体是遗传物质的载体。人类99%的遗传物质位于染色体上。染色体数目、结构的改变将导致染色体病。 五、实验步骤 （一）采血与培养: 用碘酒，酒精常规消毒后，采取静脉血1m1.分别注入装有5ml培养液的二个培养瓶中，每瓶接种血液0.5m1，加入PHA(每ml培养基内100～200 g)，轻轻摇匀后置入37℃温箱内培养。 （二）秋水仙素处理: 培养至68～72小时，加入秋水仙素使用液0.05m1(最终浓度0.04 g / m1)继续培养4～6小时。 （三）标本的制备: 1、终止培养后，将培养物混匀，倒人锥形离心管内，离心沉淀8分钟(2000r/min)，弃去上清液。 2、加入37℃预温的低渗液8m1，轻轻打匀，置37℃水浴箱中15~20分钟。 3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心8分钟(1500r/min)。 4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定液6m1，轻轻吹打混匀，置室温15分钟。 5、离心沉淀1500 r/min，6分钟。 6、弃去上情液，再加入固定液6m1，固定10分钟。 7、离心沉淀1500 r/min，6分钟。 8、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液(0.3～0.5m1)，轻轻吹打成细胞悬液。 9、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片1张，稍倾斜，用毛细滴管吸取细胞悬液，从1尺高处滴2～3滴于玻片上，立即用口对准玻片吹气，使细胞在玻片上散开，然后在酒精灯上略烘一下(勿全烘干)，在空气中待干。 （四）染色： 用Giemsa染色液染色5～10分钟，水洗，待干后即可镜检。 六、实验报告要求 结构完整 、条理分明、文字简练、书写工整、措辞注意科学性和逻辑性、正确使用标点符号。实验报告内容包括：姓班级、组别、日期、室温；实验题目；实验目的；实验