拟南芥转化 浸花法.doc

拟南芥转化—浸花法 实验步骤： 关键记录： a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。 b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。 c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。 d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。 e.干燥成熟的果夹用小袋套住。 f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。 说明： 如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。 如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。去掉用于转化植株上的果夹。 具体步骤： 1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。 2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。 注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。 3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。 浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。混匀，转移至50ml离心管。 注意：表面活性剂浓度过高有毒害。为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。在双转化试验中我们至少要用48株植株。间隔7天进行第二次浸染植株。 小心：戴手套及口罩防止表面活性剂的毒害。 4.浸染时将农杆菌悬浮液倒满50mL离心管的小盖子，将拟南芥横放使花序浸入小盖子中的悬浮液10s，轻微晃动小盖，20ml农杆菌悬浮液至少有效用于转化30株拟南芥， 150个花序以上，这一步骤要保证能在植株上看到菌液。 注意：确定所有花盆都已浸染，有时很有必要浸染整个植株确保浸染更短更多的花芽。将过多的农杆菌液移除也很重要。否则长时间的处于农杆菌溶液中会对植株有伤害。 另外，我们还可以使用移液枪吸取农杆菌溶液滴或者喷洒农杆菌溶液确保浸染所有花序。 对于生态型Ler-0，我们将农杆菌细胞悬浮于10mM MgCl2,5%蔗糖和0.02%表明活性剂混合液，悬浮液浸染10min。（这与其他生态型浸染10s不同） 5.塑料膜包滚植株让浸染后的植株保持16-24h高湿度黑暗24h。 注意：不要将植株置于高温或强光照，避免烧死。Treat the remaining Agrobacterium cell suspension with 1 volume of Clorox bleach to kill the bacteria before disposal of the suspension 6.次日去掉包裹的塑料，将浸染后的拟南芥放回温室，是它们正常生长一月，果夹掉落之前保持浇水。待收集果夹。 注意：畸形发育和不完整成熟的种子会发生在早早结束浇水或者快速干旱的转化植株。这会导致转化种子仅有单一的子叶而没有真叶。 TIMING Growth of Arabidopsis plants: 2 months Growth of agrobacteria and floral dipping transformation: 3 d Seed set and maturation of transformed seeds: 1 month Screening of primary transformants: 10–14 d 栽培过程问题分析解决方案： 1.植株有很多花但是种子很少 很有可能由于水太多光照不足引起，除去过多水分仅仅使水分覆盖托盘即可。增强光照及花盆间距。 2.没有转化 错误的载体，不适当的抗生素浓度造成。确定农杆菌含有质粒，同时，确定使用合适的抗生素浓度。 3.除草剂喷洒后所有种子sowed 喷洒过晚以至于非转化发育完善可以在抗生素下生存。可以早些喷洒除草剂。